基因工程原理-第6章外源目的基因表达与调控.pptVIP

基因工程原理 Principle of Gene Engineering 第一节 外源基因表达机制 （1）氨基酸活化和肽链的起始： AA+tRNA+ATP——AA-tRNA+AMP+PPi （2）肽链的起始： 原核生物：30S+mRNA——+AA-tRNA——+50S 真核生物：40S+ AA-tRNA——+ mRNA——+60S （3）肽链的延伸：肽基转移酶 （4）肽链的终止：终止密码子(UAA、UAG、UGA)和终止因子 （5）折叠和加工 DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。 转录起始点：通常是一个嘌呤(A或G) Pribnow框，又叫-10区：TATAAT Sextama框，又叫-35区：TTGACA 间隔区 rRNA基因启动子（Ⅰ型）：rRNA mRNA基因启动子（Ⅱ型）：mRNA、部分核内小分子RNA（snRNA） tRNA基因启动子（Ⅲ型）：5SrRNA、tRNA、snRNA 增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。 特性： 一、大肠杆菌基因表达系统 （三）常见的大肠杆菌表达系统 1. Lac表达系统 （四） 外源基因在大肠杆菌中的表达形式 包涵体——在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构。 融合蛋白——将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变2个基因阅读框，以这种方式表达的蛋白叫融合蛋白。 构建表达载体时，将多个外源基因串联连接，形成寡聚型外源蛋白。 有3种方式： 多表达单元的重组：每单元有自己的表达调控系统，表达的蛋白不须裂解处理。 多顺反子重组：共同启动子和终止子，各自的表达单元：SD序列、翻译起始合终止信号。 多编码序列重组：共同表达调控系统，但各外源基因接口有蛋白酶切位点。 ——将外源基因整合到宿主细胞染色体上， 必须整合到染色体的非必需区 同源交换 选择不能在受体细胞自主复制的质粒。 ——指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，这样的蛋白叫分泌蛋白。 终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵子末端的DNA片段，可中断转录作用。原核生物拥有两种类型的终止子，包括： 本体转录终止子（Intrinsic transcription terminators），一个发夹结构。 ρ-依赖转录终止子（Rho-dependent transcription terminators），ρ因子与RNA螺旋酶蛋白复合物。 五、 终止子 (terminator ): （一） 原核生物的终止子 ρ-依赖转录终止子 本体转录终止子 富含GC 回文结构：palindrome structure, 双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称回文结构。这两个反向重复序列不一定是连续的 （二） 真核生物的终止子 真核生物终止子，在mRNA前体的近3-端处转录产生一组共同序列，即AAUAAA和GU-rich序列，为转录终止的识别位点和poly(A)修饰识别位点。在转录越过修饰点后，RNA链在修饰点处被水解切断，转录终止，随即进行加尾修饰。 1. 复制子 常见复制子：pMB1、ColE1、pSC101。 松弛型复制子，10-20个拷贝/细胞 第三节 外源基因表达与调控 （一）大肠杆菌基因表达载体 （二）宿主菌 包括正调控系统和负调控系统： CAP因子：环腺苷酸(cAMP)与受体蛋白CRP(cAMP receptor protein)结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP(cAMPactivated protein ) ，促进RNA聚合酶结合在启动子上。 正调控系统：调控因子CAP 负调控系统：负调控因子lacI … R P O S1 S2 … … DNA 调节 基因 启动基因 操纵基因 结构基因 与阻遏蛋白结合 1.RNA聚合酶结合位点 2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点 产生阻遏蛋白 mRNA 操纵子 1. 包涵体蛋白 具有正确的氨基酸顺序，但没有生物活性； 水难溶的性质； 少受受体细胞蛋白酶影响； 易于分离纯化。 优点： 缺点： 2. 融合蛋白 受体菌蛋白N端，外源蛋白在C端 稳定性大大增加 水溶性好 易于分离纯化。 3. 寡聚型外源蛋白 4. 整合型外源蛋白 优点 缺点 5. 分泌型外源蛋白 * 第六章 DNA重组（限制性内切酶） 运输工具——基因克隆载体 目的基因的制备 目的基因导入受体细胞 外源基因的表达 基因工程的应用 目的基因