第2章 沉淀法1幻灯片.pptVIP

纯 化 方 法 沉淀法 色谱法 电泳法 第二章 沉淀法 第一节?基本原理与沉淀类型 一、基本原理 二、制备蛋白质 三、制备核酸 一、基本原理 沉淀法也称溶解度法。 基本原理：根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质（如：pH、极性、离子强度、金属离子等)，从而使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。 二、制备蛋白质 蛋白质是稳定的胶体溶液。 其原因有二： 水化膜的存在 同性电荷的相互排斥作用 蛋白质沉淀方法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 蛋白质沉淀法 聚乙二醇沉淀法 选择性沉淀法 结晶沉淀法 1．? 盐析法 盐溶(salting-in effect)：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的升高而上升。 盐析(salting-out effect)：当盐浓度增高到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出。 盐析一般操作步骤： 部分杂质“盐析”，有效成分“盐溶” ①???? 盐的选择 蛋白质沉淀，常选用硫酸铵。 优点： 1.??溶解度大，对温度不敏感。 水温25℃，硫酸铵的饱和溶解度为769g(4.1M) 水温为0℃，其饱和溶解度为679g(3.9M)； 2.?分级效果好。 去杂75%以上； 3.?有稳定蛋白质结构的作用。 经2-3M硫铵盐析的蛋白可置低温保存1年以上； 缺点：继续纯化时，需脱盐。 ② 硫酸铵盐析 A． 固体法 B． 饱和溶液法 C． 透析法 （2）?脱盐 方法：凝胶过滤法、透析法 2．? 有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二： 1、与盐溶液一样具有脱水作用， 2、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。 常用的有机溶剂是甲醇、乙醇和丙酮。 注意： ① 低温操作 有机溶剂预冷至一10℃，操作在低温进行。 3．? 蛋白质沉淀法 (1)??? 碱性蛋白质 如：鱼精蛋白 (2)??? 凝集素 如：植物凝集素 (3) 重金属 4．? 聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇〔ployethylene glycol, PEG〕和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。 沉淀条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉淀较完全，因此应用范围颇广。 但是，它也受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度以及聚合物分子量的影响。 5．? 选择性沉淀法 例如：从酵母菌细胞中纯化醇脱氢酶时就采用了改变温度的选择性沉淀法。 将酵母干粉加磷酸氢二钠溶液于37℃水浴保温2小时室温搅拌三小时。离心收集上清液，升温至55℃，保持20分钟后，迅速冷却，离心去除热变性蛋白。上清液即为热稳定的醇脱氢酶溶液。 6．? 结晶沉淀法 蛋白质沉淀：晶体沉淀 无定形沉淀(非晶体) 当某一纯蛋白质溶液的浓度达到较高(5%-30％)水平时．只要条件适合，就能产生一定形状的结晶。当蛋白溶液中混有杂质时，即使条件适合、也得不到整齐的结晶，或无结晶形成。 因此，用显微镜观察结晶的有无及形状，也可作为判断提纯物质纯化程度的一种方法。 核酸的分离与纯化 就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 核酸的分类 DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 核酸制备的一般原则 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的 有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 核酸制备的一般原则 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。pH4-10 ③减少物理因素对核酸的降解。机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 核酸制备的一般原则 核酸制备的步骤： 核酸制备的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提