黑龙江地方标准DB23：常规水稻品种纯度检测SSR方法.docVIP

ICS65.020.01 b05 DB23 黑龙江省地方标准 DB 23/ XXXXX—2017 常规水稻品种纯度检测SSR方法 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 黑龙江省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由黑龙江省农业委员会提出。 本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。 本标准主要起草人：温洪涛、关海涛、张瑞英、陈中华、马永华、丁一佳、李宛、孙丽容。 常规水稻品种纯度检测SSR方法 范围 本 本下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样GB/T 3543.5 农作物种子检验规程(PCR) 一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。 简单重复序列(SSR) 由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个碱基的串联重复DNA序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 分子标记 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异 原理 简单重复序列（SSR）分布于水稻整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目不同形成了品种间的多态性。由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的序列，因而根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，经银染，可辨别SSR电泳谱带。通过选用在亲本中具有共显性带型的SSR引物，根据PCR扩增产物电泳谱带差异，鉴定水稻品种纯度。 仪器设备 主要仪器设备包括： 测序电泳槽； 高压电泳仪（3000 V，400 mA，400 W）； 电子天平（感应为0.01 g）； 微量加样器； 磁力搅拌器； 台式离心机（最大离心力不小于15 000g）； 紫外-可见成像系统。 胶片观察灯。 水平摇床。 高压灭菌锅。 pH计。 试剂 实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682-2008规定的三级水等。乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）三羟甲基氨基甲烷（Tris）盐酸（HCl，36%）氯化钠（NaCl）氢氧化钠（NaOH）CTAB）； 氯仿：异戊醇=24：1（V：V）； 硼酸去离子甲胺溴酚蓝二甲苯青甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺尿素亲和硅烷剥离硅烷无水乙醇四基乙二胺（TEMED）过硫酸铵冰醋酸硝酸银甲醛溶液（37%）Taq DNA聚合酶（含Mg2+的10CR缓冲液）四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）SSR引物GB/T 3543.5的规定，送检样品量应不低于500g。每份样品取400粒种子作为试样。种子样品的分样和保存，应符合GB/T 3543.2的规定。 （规范性附录）20对核心引物 20对核心引物 序号 名称 序列（5’- 3’） 序列（5’- 3’） 01 RM1180 CTGCAGTGAGCCAGTGAGAG CTCCGAGCTTTTTTGACAGC 02 RM1195 CGACTCCCTTGTTCTTCTGG ATGGACCACAAACGACCTTC 03 RM1198 ATCTGGGTCGATCGGATATG CTTGGTCCTCCACAAAGAGC 04 RM1246 TCACCTCGTTCTCGATCC CTCGATCCCCTAGCTCTC 05 RM1270 AGATCATCAGCATCAACTCC ACTACCACGGACCAAAATAC 06 RM1297 CACTCCCAGTTCAGTACGTC GTGCCTTACAACTCAACGAC 07 RM1300 GCCATGTCCATTTATGGTGC CAGCCATGAATGTTGGCTAC 08 RM1331 AGCACTCAACTGATGCAGTG CACCAGCTTCATGCATGC 09 RM1342 CTAGCCAGCTCTCCCTTTTG AGAAACCAAAGATGGGAGGG 10 RM1347 GTCTTATCATCAGAACTGGA AACAAATTAAACTGCCAAG 11 RM1350 AAATCAGCAAGAAAGCTCTG CGCCCTAGTAGATAGGTAATTG 12 RM1359 TTCTTCTCATTTCAATTCGC AACGAATTCTATTTTGCGTC 13 RM1364 AAAACATCTACTTTGATCCA AAGAAATTCAAAACACATGA 14 RM1370 GGAGGGAGGAATGGGTACAC AAACGAGAACC