土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单.doc

第2课 土壤中分解尿素细菌的分离与计数 知识清单 一、研究思路 1．筛选菌株 (1)实验室中微生物筛选的原理 人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________或________其他微生物生长。 (2)选择培养基 在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。 (3)分离分解尿素的细菌的选择培养基 ①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。 ②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是________________________________才能在该培养基上生长。 ③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。 Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。 2．统计菌落数目的方法 (1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。______________是成功地统计菌落数目的关键。 ②操作 第一，设置__________组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。 第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。 ③计算公式：每克样品中的菌株数＝×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。 (2)设置重复和对照 ①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。 ②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是排除________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。 二、实验设计 实验步骤 1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。 2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。 ②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。 ③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。 3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有________ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从_____到______的顺序涂布平板，不必更换移液管。 说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。 4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。 5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。 6．细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在____