荧光光谱法定量测定纤维素酶活性架构中单个氨基酸突变对底物结合力.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2016, 43(11): 1086~ 1093 光光谱法定量测定纤维素酶活性架构中单个 氨基酸突变对底物结合力的影响* 培培 张丽丽 张 庆 禄山 陈冠军** ( 东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100) 摘要 纤维素酶活性架构是酶分子中多个氨基酸残基构成的可结合并催化底物的功能区，其中色氨酸等芳香族残基在该区域 中起着重要作用 本研究利用荧光光谱法，定量分析了纤维素酶 Cel5A 活性架构中色氨酸与底物的结合动力学过程，通 Ch 过色氨酸荧光猝灭的定量分析，确定了色氨酸特异性结合时的底物浓度范围，并且测定了 Cel5A 活性架构中单个氨基酸 Ch 突变导致的底物结合常数的变化，与催化动力学参数比较发现，荧光光谱法可准确表征纤维素酶与底物的结合力及其单个残 基突变引起动力学参数的变化 此外，由于pNP 中含有强的吸电子基团，因而以pNPC 等为配体时会高估与色氨酸的结合 常数约20～100 倍 荧光光谱法可以测定纤维素酶结合糖分子底物的动力学参数，该方法具有灵敏和快速的特点，这为蛋白 质与底物之间相互作用的定量分析提供了新的视角 关键词 荧光光谱法，纤维素酶，色氨酸，活性架构，结合力，定量分析 学科分类号 Q81，Q93 DOI: 10.16476/j .pibb.2016.0205 木质纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富 导电子轨道变迁发生荧光猝灭现象，其猝灭强度与 的可再生资源[1-2] 自然界中纤维素的降解主要是 配体分子的结合量之间具有剂量效应关系[12-13] 根 多种纤维素酶的协同作用完成的[3-5] 纤维素酶 据猝灭过程以及Stern-Volmer 方程可以进一步计算 的活性中心架构包括结合残基和催化残基，前者负 出色氨酸与猝灭剂的结合常数，从而计算结合力等 责与纤维素等底物的结合，后者负责催化底物断 相关参数[14] [6] 键 酶分子与纤维素底物的高效结合是其催化断 近几年，荧光光谱法已被广泛应用于蛋白质与 [15] [16] 键的前提，因此定量测定酶分子与底物的相互作用 配体结合过程的研究 例如，Bian 等 利用色氨 [7] 是探索其构效关系的基础 酶分子活性架构中的 酸荧光猝灭的方法探究了染料木黄酮与人血清白蛋 [8] 氨基酸在底物识别过程中扮演着重要的角色 ，不 白之间的结合，确定了两者之间的结合常数 另 [17] 同氨基酸结合底物残基的位置不同，因而提供结合 外，Wang 等 利用荧光光谱法对溶菌酶与头孢菌 能力的贡献大小不同，因此研究活性架构中不同 素类似物之间的结合行为进行研究，发现不同的药 氨基酸的功能可以指 酶分子的理性设计与改造过 物与溶菌酶具有不同的结合力 因此，荧光光谱法 程[9-10] 已经成为研究荧光体与配体结合力的有利工具[18]