聚合酶链式反应(PCR)中主要污染源及处理方法的分析.pdfVIP

农业开发与装备 2017年第3期 交 流 探 讨 聚合酶链式反应（PCR)中主要污染源 及处理方法的分析 唐艳荣，张海云 ，曹院章，许东保，郭 睿，张雪梅，王雅琴* （北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京市 100018） 摘要：对聚合酶链式反应 （PCR ）中主要污染源及处理方法逐一 6 ）离心机 ； 进行分析 。 7 ）冰箱 门把手 ，冷冻架 ，门把手或实验台面等 ；此时可用擦 关键词：聚合酶链反应 （PCR ）；污染源 ；处理方法 拭实验来查找可疑污染源。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ，PCR)是一种选择 ①用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源 ； 性体外扩增 DNA或RNA 片段 的方法 ，在微生物感染 的诊 断 中具 ②0.1ml去离子水浸泡 ； 有重要 的价值 。在PCR扩增过程 中 ，扩增 的DNA产量是呈指数上 ③取5ml做PCR实验 ； 升 的 ，经过n个循环 的扩增 ，一个DNA分子 的产量便达到2n个拷 ④ 电泳检测结果 ，看检测结果是否为阳性 。 贝。PCR产物一般为 1 0 13拷贝/ml ，取0.1ml 即为 109拷贝 ，而 1mg 8 ）气溶胶 。如果经过上述追踪实验 ，仍不能查找到确切污染 人基 因组DNA才含 1.4 106拷贝的单拷贝基 因片段 ，因此使得PCR 源 ，则污染可能是 由空气 中PCR产物 的气溶胶造成 的 ，此 时就应 扩增反应具有强大 的扩增能力 ，提高 了检测 的敏感性 。此外 ，利 该更换实验场所 ，若条件不允许 ，则重新设计新 的引物 （与原引 用PCR反应 ，还能够对感染 因子实施定量分析 ，实时监测其在宿 物无相关性 ）。 主体 内的动态变化 ，有利于指导临床诊疗 。正是 由于PCR反应具 1.3 PCR反应中，主要存在三个污染源 有强大 的扩增效率 ，也导致其易污染 的缺点 ，极微量 的污染便可 1 ）标本间的交叉污染 ； 导致假 阳性结果 。进行PCR操作 时 ，操作人员应该严格遵守一些 2 ）实验室克隆质粒的污染 ； 操作规程 ，最大程度地降低可能 出现 的PCR污染或杜绝污染 的出 3 ）PCR扩增产物的污染 。 现 。如果检测过程 中不慎发生污染情况 ，应逐一分析 ，排除其污 其 中以第三个污染源最主要 ，通过下面一个例子便可认识到 染源。 PCR产物污染 的严重性 。在 100ml 的反应管 中可产生1 0 12拷贝个分 1 污染源的分析 子 ，若将这些分子在一个标准游泳池 （50m25m2m ）内稀释后 ， 检测过程 中如果不慎发生污染情况 ，应从下面几条 出发 ，逐 0.1ml稀释液含有400拷贝的扩增分子 ，远远超过了PCR扩增反应检 一分析 ，排除污染源。 测数个拷贝的极 限。因此 ，PCR检测微量感染 因子时 ，一定要注 1.1 设立阴阳性对照 意产物残 留污染 的问题 ，对 临床实验室尤应如此 。本文就PCR污 有利于检测反应体系各成分 的污染情况 。选择 阳性对照时 ， 染 的预防、污染源的追踪及污染 的处理进行分析 。 应选择扩增弱 ，且重复性好 的样 品 ，因强 阳性对照可产生大量不 2 污染的预防 必要 的扩增序列 ，反而可能成为潜在 的污染源 。如果 以含靶序列 进行PCR操作 时 ，操作人员应该严格遵守一些操作规程 ，最 的重组质粒为对照 ，100个拷 贝之 内的靶序列就足 以产生 阳性扩 大程度地降低可能出现