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单核苷酸多态性（SNP） 林壹明 2011/5/9 主要内容 一、SNP概念、分类与特点 二、SNP检测技术 三、SNP研究现状 四、SNP应用前景 SNP概念 SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占80%。 一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。 SNP分类 根据在基因中的位置，SNP 可分为基因编码区SNP(coding SNP, cSNP)、基因内含子区SNP和基因调控区SNP(regulatory SNP, rSNP)。 其中cSNP根据是否改变编码的氨基酸又可分为同义cSNP (synonymous cSNP)和非同义cSNP (non-synonymous cSNP)。 SNP的主要特征 （一）、密度高。SNPs 在人类基因组中的总数超过300万。 （二）、遗传稳定性好。 （三）、分布不均匀。非编码区的数目远远大于编码区的数目。 （四）、具有代表性。 （五）、分析易自动化。由于每个SNP 位点通常仅含两个等位基因——双等位基因(biallele)，在检测时能通过一个简单的“+/?”分析进行基因型分型，而无需分析片段的长度，因而易于自动化。 SNP检测技术 理想的检测SNPs的方法 ——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs 必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的检测与分析。 现在常用的SNP检测技术： 1.基于杂交的方法 2.基于酶的方法 3.电泳法 4.直接测序法 另外还包括化学法（如高锰酸钾法），物理法（例如基质辅助的激光吸附／离子化飞行时间质谱分析）等。 1.基于杂交的方法 原理: 短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，在完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs 位点检测出来。（Tm差异越大，检测的特异性就越好） 分为： (1）利用△Tm； (2）杂交+荧光探针。 (1)利用△Tm 固定温度 等位基因特异核苷酸探针 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修饰过的探针：引入一个错配的碱基、 PNA、 LNAs 等 动态的加热过程 动态等位基因特异杂交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH) 核酸肽探针（Peptide nucleic acids，PNA) 其骨架是肽键 特点： 1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）； 2、链挤入 （形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）； 3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）。 与靶分子高特异性地结合 Tm值高 受盐浓度影响小（低盐浓度的体系） △Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度） 所以，PNA/DNA的非特异结合能得到很好的排除。 LNA(locked nucleic acids) 其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。 特点： 1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA 或LNA 结合（构象更利于杂交的稳定） 2.匹配和不匹配之间的△Tm增加 DASH(dynamic allele-specific hybridization） （2）杂交+荧光探针 分子信标（双分子间杂交） 分子信标（Molecular beacons） 2.基于酶的方法 1）DNA聚合酶 2）连接酶 3）限制性内切酶 4）外切酶FEN 5）RNase H DNA聚合酶法 Taqman法 单碱基延伸法 焦磷酸测序法 Taqman 法 单碱基延伸法（single base extension) 基本步骤 1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA。 2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)。 3.引物延伸。 4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）。 焦磷酸测序法(Pyrosequencing ) 原理：DNA 聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的