农产朴敕与分析(蛋白质测定)-3-1.pptVIP

第五章 蛋白质的测定; 蛋白质的测定方法;测定蛋白质最常用的方法为凯氏定氮法 凯氏定氮法是通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。经过人们长期的应用和不断改进，凯氏定氮法已演变成常量法、微量法、半微量法、改良凯氏法及自动定氮法等。;优点： 具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点。 缺点： 操作较费时(除自动凯氏定氮法外)，单消化过程一般就需要2～3h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5h以上；在操作过程中会产生大量有害气体。 ; 为满足生产单位对工艺过程快速控制分析，减少环境污染和操作简便省时，后来在凯氏定氮法的基础上又陆续出现了水杨酸比色法、双缩脲法、水合茚三酮法、染料结合法、紫外分光光度法、折光法、旋光法、近红外线光谱法以及测定开氏消煮液中铵的靛酚蓝法和纳氏比色法。;重点介绍凯氏定氮法、染料结合法、双缩脲法 三种方法。 测定氨基酸主要的方法是利用氨基酸自动分析仪、茚三酮法、染料结合法、乙醛酸法、荧光法等。 重点介绍氨基酸自动分析仪法测定全氨基酸、染料结合法测定赖氨酸及乙醛酸法测定色氨酸。; 粗蛋白质的测定;优点：具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点。缺点：操作较费时(除自动凯氏定氮法外)，单消化过程一般就需要2～3 h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5 h以上；在操作过程中会产生大量有害气体。 ;我们在检验农产品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算因数，得到蛋白质含量，实际上包括氨基酸、酰氨、核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故称为粗pro。 如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。;（一）方法原理; 样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。该过程的反应方程式表示如下：;消化：2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4 (NH4)2SO4 + 6CO2↑+ 12SO2 + 16H2O 蒸馏：(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3↑+ Na2SO4 + 2H2O 吸收：2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO4;在消化过程中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾、硫酸铜等物质。加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。但其加入量不能太大，否则消化温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。;（二）操作步骤; 样品 （0.5mm）;2、蛋白质的消煮;3、氮的测定;(三)各种试剂的作用:;CuSO4的作用（催化剂） 起催化作用外，还可作消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 Cu2SO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色。;3、硒粉和过氧化氢、氧化汞都为催化剂，但考虑到效果、价格及其环境污染等，通常采用硫酸铜。 4. NaOH的作用 碱性条件下蒸馏使氨游离。;5、K2SO4的作用（提高沸点） 沸点由330℃提高到400℃加速了反应过程，加速有机物的分解。;（四）适用范围;（五）注意事项;（五）注意事项;3、消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。 4、消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2-3ml，促使氧化。;5、在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。 6、如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过少，底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。;7、混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。 8、氨是否完全蒸馏出来，pH试纸检查馏出液是否为碱性。;9、向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深蓝色的络