叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定.pptVIP

叶绿体色素的提取、分离、 理化性质和叶绿素含量的测定 一、实验目的和要求：掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 二、实验内容和原理：以菠菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质分析和叶绿素含量测定。 2、叶绿素的荧光现象 3、取代反应 5、定量分析：叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中665 和649用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量测定 实验步骤 1．定性分析： 取鲜叶3-5g+95%乙醇15-25ml（逐步加入）,磨成匀浆 ? 2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 3．叶绿素定量分析： 称取鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份0.2ml 分别加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在649，652，665测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 五、实验数据记录和处理 Ca(mg/L)=13.95A665-6.88 A649 Cb (mg/L) =24.96A649-7.32 A665 CT (mg/L) = Ca+ Cb 或A652?1000/34.5 1、您所测得的总叶绿素含量为多少？请列出计算过程。 2、为什么叶绿素吸收红光和蓝紫光？ 3、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？为什么？ 4、讲义P47-4 * 省培项目 1、叶绿素和类胡 萝卜素均不溶于 水而溶于有机溶 剂，常用95%的 乙醇或80%的丙 酮提取。 透射光下呈绿色 反射光下呈暗红色 C C C C N C C C C N C C C C N C C C C N HH C CH HC C CH2 CH CH3 R1— H3C H3C— —CH3 C C C C N C C C C N C C C C N C C C C N Cu C CH HC C CH2 CH CH3 R1— H3C H3C— —CH3 褐色 绿色 C32H30ON4Mg COOCH3 COOC20H39 + 2KOH C32H30ON4Mg COO— COO— + 2K+ +CH3OH +C20H39OH 4、皂化反应 ？ ？ a b Relative absorbtance Waverlength(nm) 过滤入三角瓶中 观察荧光现象 透射光 色，反射光 光。 皂化反应(约1ml) 加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O 1ml 分层后观察 上层呈 色，为 ，吸收 光。 下层呈 色,为 , 吸收 光。 取代反应（约1mL） 加醋酸约1ml，变褐 为_________叶绿素 , 取1/2加醋酸铜粉,加热变 色，为 叶绿素。 定性实验 无需移液管量 皂化反应的上层黄色石油醚溶液 弃上层，反复用石油醚萃取,直到无类胡萝卜素, 得叶绿素(盐) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰 （稀释470nm OD 0.5-1） （稀释，665nm OD 0.5-1） *