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动物布鲁氏菌病诊断技术 GB/T18646—2002 ??? 本标准规定了动物布鲁氏菌病的诊断技术。 ??? 本标准规定的虎红平板凝集试验、乳牛全乳环状试验适用于家畜布病田间筛选试验和乳牛场布病的监测及诊断泌乳母牛布病的初筛试验；试管凝集试验和补体结合试验适用于诊断羊种、牛种和猪种布病感染的家畜。 ??? 本标准规定的试管凝集试验不适用于犬种和绵羊副睾种布病感染家畜的检疫。 2　虎红平板凝集试验 2.1　材料准备 2.1.1　抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。 2.1.2　受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和无腐败气味。 2.1.3　洁净的玻璃板，其上划分成4cm2的方格。 2.1.4　吸管或分装器，适于滴加0.03mL。 2.1.5　牙签或火柴杆，供搅拌用。 2.2　操作方法 2.2.1　将玻璃板上各格标记受检血清号，然后加相应血清0.03mL。 2.2.2　在受检血清旁滴加抗原0.03mL。 2.2.3　用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。 2.2.4　每次试验应设阴、阳性血清对照。 2.3　判定 2.3.1　在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。 2.3.2　受检血清在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性(+)，无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性(—)。 3　乳牛布病全乳环状试验 3.1　材料准备 3.1.1　布病全乳环状抗原 ??? 由制标单位提供，按说明书使用。 3.1.2　乳样 3.1.2.1　受检乳样须为新鲜的全乳。 3.1.2.2　采乳样时应将母畜的乳房用温水洗净、擦干，然后将乳液挤入洁净的器皿中。 3.1.2.3　采集的乳样夏季时应于当日内检查；保存于2℃时，7d内仍可使用。 3.2　操作方法 3.2.1　取乳样lml，加于灭菌凝集试验管内。 3.2.2　取充分振荡混合均匀的全乳环状抗原1滴(约50ul)加人乳样中充分混匀。 3.2.3　置37℃一38℃水浴中60min。 3.2.4　加温后取出试管勿使振荡，立即进行判定。 3.3　判定 ??? 标准分为： ??? a)强阳性反应(+++)，乳柱上层乳脂形成明显红色的环带，乳柱白色，临界分明； ? ??b)阳性反应(++)，乳脂层的环带呈红色，但不显著，乳柱略带颜色； ??? c)弱阳性反应(+)，乳脂层的环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深； ??? d)疑似反应(±)，乳脂层的环带颜色不明显，与乳柱分界不清，乳柱不褪色； ??? e)阴性反应(—)，乳柱上层无任何变化，乳柱颜色均匀。 4　动物布病试管凝集试验 4.1　材料准备 4.1.1　稀释液 ??? 0.5%石炭酸生理盐水。检验羊血清时用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，如果血清稀释用含0.5%石炭酸的10%盐溶液，抗原的稀释应用含0.5%石炭酸的10%盐溶液。 4.1.2　抗原、阳性血清和阴性血清由制标单位提供，按说明书使用。 4.1.3　凝集试验管(三分管)、试管架、吸管及温箱。? ?? 4.2　操作方法 4.2.1　按常规方法采血分离血清。 4.2.2　运送和保存血清样品时防止冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，按每9mL血清加1ml 5%石炭酸生理盐水(徐徐加入)防腐，也可用冷藏方法运送血清。 4.2.3　受检血清的稀释 ??? 以羊和猪为例，每份血清用4支凝集试管。 4.2.3.1　第一管标记检验编码后加1.15mL稀释液。 4.2.3.2　第2—4管各加入0.5mL稀释液。 4.2.3.3　然后用1ml吸管取被检血清0.1mL；加入第1管内，并混合均匀。混合方法是将该试管中的混合液吸人吸管内，再沿试管壁吹入试管中，如此吸入、吹出3—4次，充分混匀后以该吸管吸混合液0.25ml弃去， 4.2.3.4　取0.5mL混合液加入第2管，用该吸管如前述方法混合。 4.2.3.5　再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去混匀液0.5mL。 4.2.3.6　稀释完毕，从第1至第4管的血清稀释度分别为1：125、1：25、1：50和1：100。 4.2.3.7　牛、马、鹿、骆驼血清稀释法与上述基本一致，差异是第一管加1.2mL稀释液和0.05mL被检血清。 4.2.3.8　将0.5mL20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀，羊和猪的血清稀释则依次变为1：25、1：50、1：100和1：200，牛、马和骆驼的血清稀释度则依次变为1：50、1：100、1：200和1：400。 ??? 大规模检疫时也可只用2个稀释度，即牛、马、鹿、骆驼用1：50和1：100，猪、山羊、绵羊和狗用1：25和1：50。 4.2.3.9　 置37℃—40℃温箱24h，取出检查并记录结果。 4.2.3.10　每次试验均应设阳性血清、阴