感染性疾病的分子诊断20110418.pptVIP

基因病的分子诊断 Molecular diagnosis for genic diseases;基因病概念;基 因 病 ;中国：引起死亡的主要疾病;基因病的分子诊断;基因病的分子诊断技术;支链DNA技术（branched DNA, bDNA）;基因病的分子诊断技术;基因病的分子诊断技术;第十章 感染性疾病的分子诊断 Molecular diagnosis for infectious diseases;感染的慨念; 感染后果（转归） ;感染性疾病的分子诊断策略;感染性疾病分子诊断标志物;定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据;第一节 病毒的基因检测;病毒;检测病毒的方法;乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）;第一节 病毒的基因检测;HBV在肝细胞内的复制;HBV基因组结构;急性感染时期HBV的标志物;HBV 基因分型;第一节 病毒的基因检测;1．样本处理（样本处理区） 2．核酸扩增 2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区） ;HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）;HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）;HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）;HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）;HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）;HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）;HBV DNA FQ-PCR（real-time PCR）;第一节 病毒的基因检测;YMDD突变检测方法;HBV的分子诊断的临床应用;丙型肝炎病毒（HCV）;HCV;HCV基因组（单链RNA）;HCV基因分型的多样性;HCV分子诊断;HCV分子诊断;HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件） 1 样本处理（样本处理区） 1.1 阳性对照：先用100ulDEPC水复溶血清冻干粉制成强阳性对照；取10ul强阳性对照制成临界阳性对照； 1.2 标记：取n个0.5ml灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照）； 1.3 先加150ul裂解液，后分别加50ul样本（待测样本、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照），再加入50ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）； 1.4 13,000rpm离心15min（如有条件,于4℃进行离心）； 1.5 另取n个0.5ml灭菌离心管，加入100ul异丙醇（-20℃预冷），作好标记；吸取步骤1.4各管中的上层液相互转移至相应的管中，颠倒混匀； 1.6 13,000rpm离心15min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入300ul 75%乙醇，颠倒洗涤； 1.7 13,000rpm离心10min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体； 1.8 4,000离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥1-5min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）； 1.9 加16ul EDPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000rpm离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请立即进行后续步骤）;HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件） 2．扩增试剂准备（PCR前准备区） 从试剂盒中取出HCV RT-PCR反应液、PCR Enhancer，在室温下融化后，2,000rpm离心5sec，设所需Roche专用毛细管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照），每个测试反映体系配置如下表： 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，并向其中加入n/2颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀向每个Roche专用毛细管中各分装9ul，转移至样本处理区;HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件） 3．加样（样本处理区） 在各设定的Roche 毛细管中分别加入上述样本处理步骤1.9中制备的RNA溶液各16ul，盖紧毛细管管盖，连同Roche专用金属毛细管套放入离心机中，于2,000 rpm离心5sec，将毛细管排好放入Roche PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序 4．RT-PCR反应（检测区） 4.1 循环条件设置 4.2 仪器检测通道选择F1通道;HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件）;HCV RNA定量（real-time RT-PCR）（SOP文件）;