蛋白层析纯化系统.PDFVIP

蛋白层析纯化系统 FPLC：快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography） 一、操作流程： （一）开始层析实验前的准备 注意：紫外灯：如果只是平衡层析柱，关闭紫外灯。UPC-900面板旋钮逆时针旋转，进入 Lamp （on），点击OK，通过旋钮选择ON 或OFF。一般在上样前15min 打开紫外灯。 1、检测系统管路中是否有气泡。若有小气泡，可以使用pump wash，以大流速冲走气泡； 若有大气泡，需要用注射器手动排气。 2、打开FPLC 的电源，系统立即进行自检 3、打开电脑电源 4、双击 unicon 5.11图标，进入系统窗口。ÄKTA 层析软件有四个窗口：UNICORN Main Menu、Method Editor、System Control、Evaluation。如使用程序运行，在Method Editor 窗口里编方法设置各种参数；如使用手工运行，在System Control 窗口里设置各 种参数。 （1）清洗及管路准备：System Control 设置参数 Pump→Pump Wash 选择要冲洗的泵（Pump A 和 Pump B）→Execute，冲洗 完成后系统自动停止，之后可进行报警压力的设置：Alarms ＆Mon→Alarm_Pressure→ HighAlarm，设置最高报警压力（柱压力加0.2MPa）→Execute （2）安装层析柱 设置较小的流速 Pump→Flow 0.5mL/min。将层析柱接入系统：样品阀1号为的连 接管有液体滴出时，将层析柱上端堵头去掉，把连接管插入，注意不要拧紧；打开下端堵头， 与UV 检测器上的接头连接，再把上端接头拧紧。（拆层析柱时，先把连接UV 检测器端的 接头拧开，堵上堵头，在把上方连接去掉。） （3）在Method Edit 窗口中进行方法编辑 （也可参照下一部分进行手动运行） 进入 Method Edit 窗口，点击“新建方法” 。New Method→Use 中选择 Method Editor→OK→Prameters：Base （用于确定各个命令的开始点），可选择Time、 Volume 和CV （柱体积），现在按体积Volume 来确定命令开始点→Insert Alarm＆Mon→Alarm_Pressure→HighAlarm （柱压力加0.2MPa）→Insert Pump→Flow：1 mL/min→Insert 以上设置的命令都是在0 mL 的breakpoint 时进行的，之后在Breakpoint 中输入 需要插入新命令的点（可以是时间、体积或柱体积，这里以体积为例）：5 mL，以及需要执 行的命令：Flowpath→Injection Valve：Inject→Insert，以此类推，将需要执行的命令 插入到相应段点中。 Alarm＆Mon→Auto ZeroUV→Insert ↓ Breakpoint：5.5 mL，Flowpath→Inject Valve：load→Insert ↓ Breakpoint：7 mL，Pump→Gradient：Target 100 ％B， Length （到达Target 的体积）：10 mL→Insert，Frac→Fractionation：FracSize：1 mL→Insert ↓ Breakpoint：19 mL，Others→End-Method→Insert ↓ 保存方法：输入 Method Name 和Technique （纯化类型） 运行保存的方法：进入System Control 窗口，File→Run，选定方法，显示运行提 示→START。之后只需将样品注入样品环，放好收集管，系统自动完成。 （二）手动运行开始层析实验 1、平衡层析柱：System Control 设置参数 Manual→Pump→Flow：1 mL/min→Insert Alarm ＆Mon→Alarm_Pressure→Mode：Enabled，HighAlarm （柱压力加0.2MPa） →Insert Other→Record On ↓ Execute，平衡层析柱 2、上样 （1）用loop 上样： 正向上样：先用缓冲液