第五章分子生物学研究法上.ppt

分 子 生 物 学 (Molecular Biology);第五章 分子生物学研究法（上） --DNA、RNA及蛋白质操作技术;引 言;本章的主要内容;第一节 重组DNA技术回顾;重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）;二、重组DNA技术的基本步骤 ;三、重组DNA技术的四大要素;（一）目的基因（外源基因）的获取;（二）载体;;（2）按进入受体细胞类型分类：;;（3）按载体来源分类：;常见载体的种类和特征;2、载体应当具备的条件;;（三）工具酶; 我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：;1、限制性核酸内切酶 “分子手术刀”;命名原则:;识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 即反向重复结构，以DNA分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。;Bam HⅠ; 如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。;2、DNA连接酶 “分子缝合针”;外源基因与载体的连接方式：;（2）平端连接;（3）同聚物加尾连接;（4）人工接头;（四）宿主细胞;二、细菌转化与目标DNA分子的增殖;常用细菌转化的方法1CaCl2法;常用细菌转化的方法2电转化法;;克隆的筛选和鉴定：; 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。 ;X-gal;（LacZ基因 N端序列）;;细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程;λ噬菌体作为克隆载体的克隆过程;第二节 DNA的基本操作技术;一、核酸的凝胶电泳;凝胶电泳的基本原理; 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈负离子化状态。同时，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同大小的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。;常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。 ; 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来的。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经化学修饰后，琼脂糖的熔点会降低（低熔点琼脂糖），在较低温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。催化聚合的常以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。;琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50 kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1, 000 bp之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。;琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力;凝胶的EB染色;溴化乙锭染料对DNA分子的插入作用; 在凝胶电泳中或后，加入溴化乙锭（EB）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 DNA，也可以被清晰地检测出来。;凝胶成像仪;脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）;B+;二、聚合酶链式反应;;PCR基本原理;;反应材料;PCR反应步骤;PCR仪;PCR仪;三、DNA测序技术双脱氧链末端终止法;四、实时定量PCR;Theoretical;实时定量PCR的基本原理;Real time PCR 常用方法;;;优点：① 通用性好，只需要设计PCR引物。 ② 方法简便，省时，价格低廉。 缺点：由于荧光染料和模板的结合是非特异性的，可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA，不能有效区分目的双链DNA和非目的DNA分子，所以有时不能真实反映目的基因的扩增情况。;2、特异性荧光探针法;TaqMan荧光探针：;5’;5’;五、基因组DNA文库的构建;构建基因组DNA文库需考虑的问题 代表性和随机性; 为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目， Clark和Carbon 于 1975 年提出如下的计算公式：;基因组DNA文库的类型;基因组 DN