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选修3《现代生物科技专题》知识点总结专题1 基因工程一、概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。二、基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”--限制性核酸内切酶（限制酶）1、来源种类：主要是从原核生物中分离纯化出来的，约有4000种。2、功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（回文序列），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开3、切割方式及结果（教材5页图1-3）：错位切---黏性末端；平切---平末端（二）“分子缝合针”--DNA连接酶1、来源种类：从大肠杆菌分离得到的E·coliDNA连接酶；从T4噬菌体中分离得到的T4DNA连接酶2、功能（教材5页图1-4）：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E·coliDNA只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来；而T4DNA连接酶能“缝合”两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。3、与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。（三）“分子运输车”--基因进入受体细胞的载体1、载体具备的条件：（1）能在受体细胞中复制并稳定保存。（2）具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。（3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（4）大小合适，以便提取和在体外进行操作（5）具有一定的安全性，对受体细胞无毒害作用2、最常用的载体是质粒（教材6页图1-5）,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。3、其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒4、在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。三、基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤（教材8页图1-6）：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定（一）目的基因的获取1、目的基因：主要是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子2、方法：从自然界中已有的物种中分离及人工合成（1）从基因文库（基因组文库和cDNA文库）中获取目的基因（2）利用PCR技术扩增目的基因（教材10页图1-8）PCR是聚合酶链式反应的缩写，由穆里斯等人发明，在PCR扩增仪中完成。实质：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。原理：DNA双链复制前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物条件： 模板（目的基因）、原料(脱氧核苷酸)、引物（一小段单链DNA）、热稳定DNA聚合酶、酶促反应所需离子等、温度控制过程：第一步：（变性）加热至90～95℃DNA解链；第二步：（复性）冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：（延伸）加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物开始互补链的合成；第四步：多次重复。（3）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成3、获取目的基因的三种方法比较（1）如果知道目的基因全序列或两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用PCR技术扩增（2）如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用化学方法人工合成（3）如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用构建基因文库的方法（二）基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止。（3）标记基因：是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因等。3、构建过程（三）将目的基因导入受体细胞1.转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法（原理：农杆菌感染双子叶植物和裸子植物，其细胞中Ti质粒上的T-DNA能够转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上。过程：见下图--教材12页图1-11），其次还有基因枪法和花粉管通道法等。②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。操作程序是：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 转基因受精卵 胚胎早期培养胚胎移植