1---血凝和血凝抑制实验.ppt

血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验 一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备 一、实验目的 1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识 二、实验内容 1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测） 三、实验原理 1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。 2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。 四、实验材料 1、血凝板（96孔90oV型） 2、新城疫阳性血清 3、被检血清（1份） 4、1％红细胞悬液 5、稀释液 6、移液器（50ul, 2人/把） 7、枪头 五、实验方法与结果判定 血凝试验（HA) 1、在血凝板上第一排和第二排的1－12孔内各加入25ul生理盐水 2、在第1孔内加入25ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃25ul（也就是可以一次做2个抗原效价测定） 3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul 4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟 5、结果判定 结果判定标准 1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集； 血凝价的判定 以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？。 25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一个血凝单位。 血凝抑制试验 1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32） 2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水； 3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第10孔，最后弃25ul； 4、第1－11孔内加入4单位抗原25ul（第11孔为抗原对照第12孔为红细胞对照）； 5、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟 6、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul； 7、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟 8、结果判定 结果判定标准 1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块，即50％凝集； 4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。 血凝抑制价的判定 以出现完全抑制凝集(即不凝集) 的血清最高稀释倍数为该血清的血凝抑制价（1:4）即抗体为22。 六、注意事项 1、红细胞用前请摇匀 2、用枪加样定要准，尽量不要有气泡 3、结果判定有耐心 4、HA和HI勿相混 红细胞的制备 1、采SPF鸡血20-40ml于加抗凝剂的试管中（真空采血管） 2、用生理盐水以1:5的比例稀释鸡全血后放入离心管中以1500r/min离心10min， 3、离心后用移液器吸取上清液，再次加入生理盐水稀释并以1500r/min离心10min。 4、离心后用移液器吸取上清液，再次加入生理盐水稀释并以1800r/min离心8min。 5、离心后用移液器吸取上清液，剩余红细胞配制为10%的红细胞溶液，4℃保存备用。 注意事项 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。 * * 病毒颗粒 红细胞 I am late！ 抗体 抗原 ＋（红细胞凝集在壁上） 25 25 25 25 256 × 8 － 25 25 25 25 512× 9 － 25 25 25 25 1024 × 10 － 25 25 25 25 2048 × 11 红细胞对照 128 × 64 × 32 × 16 × 8 × 4 × 2 × －（红细胞沉积在底部） ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ 结果 25 25 25 25 25 25 25 25 红细胞 弃25