第八篇 酶免疫技术.pptVIP

《免疫学检验》 吴倩 讲师 卫生检验系 公共卫生学院 南京医科大学 025uqian@njmu.edu.cn 第八章 酶免疫技术 第一节　酶免疫技术的原理 第二节 酶免疫技术的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 固相酶免疫测定的技术要点 第五节 酶免疫组织化学技术 第六节 其他酶免疫技术 第七节 酶免疫测定的应用 第一节 酶免疫技术的原理 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 第二节　酶免疫技术分类 EMIT示意图 CEDIA示意图 分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定 第三节　酶联免疫吸附试验 　 三个部分： 免疫反应 酶与底物反应 检测方法的建立 第四节 固相酶免疫测定的技术要点 一、试剂的准备 （一）固相载体 聚苯乙烯 特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量ELISA板 使用前检测其性能 （二）抗原和抗体 高纯度的Ag 高效价的Ab 一、试剂的准备 （三）酶和底物的选择 标记酶的要求： 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 二、酶标记抗体或抗原的方法 二、酶标记物的纯化和鉴定 四、最适工作浓度的选择(棋盘法) 五、测定方法的标准化 包被 加样 洗涤 孵育 结果判定 理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特异性吸附较少 包被机制 1、物理性吸附（被动的） 2、共价交联（戊二醛，标准化） 影响包被的因素 1、包被物质的性质及其浓度 2、包被缓冲溶液的pH及离子强度 3、包被温度和时间 包被物质的性质及其浓度 聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗体效果好 浓度过高引起前带现象 浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭) 包被缓冲溶液的pH及离子强度 相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面 包被温度和时间 置4℃冰箱过夜，或37 ℃孵育2h 加样 加样量准确 加样位置 不产生气泡 洗涤 目的 1、洗去未结合的物质 2、洗去非特异性吸附 要求 1、每孔充满液体 2、去净洗涤液（Tween20） 3、冲洗次数和浸泡时间足够 4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗 孵育 定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间，整个过程称为孵育或温育。 方法：干式 湿氏 推荐温度：37℃ 增强作用:聚乙二醇 反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点 结果判定 1、吸光度法（A） 2、比例法(A/A0) 3、滴度法（倍比稀释样品） 4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化） 5、标准曲线法 酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry technique) 定义 在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通组织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分析也可达到定量的目的。 种类 1、标记抗体免疫组织化学技术 2、非标记抗体酶免疫组织化学技术 3、酶标记免疫电镜技术 1、标记抗体免疫组织化学技术 其他酶免疫技术 免疫印记法（immunoblotting test） 生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试验