第二篇 沉淀.pptVIP

生物分离过程的一般流程 初级分离 概念：指从菌体发酵液、细胞培养液、细胞破碎液及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程 特点：分离对象体积大、杂质含量高，初级分离技术应具有操作成本低、适于大规模生产的优势 方法：离心、过滤、沉淀、膜分离、萃取、吸附 第二章 沉 淀 定义：沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。具有浓缩与分离的双重作用。 与结晶联系：在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化。 区别：结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出；沉淀为不定形的固体颗粒，构成成分复杂，纯度低。 优 点 设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； 原料液体积很快地减小10-50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 及早地将目标pro从其pro水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性。 第一节 蛋白质表面性质 第二节 各种沉淀方法 第一节 蛋白质表面性质 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质水溶液呈胶体性质 使蛋白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白质凝聚沉淀的因素： 蛋白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的水化层 蛋白质分子间的静电排斥作用（双电层） 第二节 各种沉淀方法 一、盐析沉淀（重点） 二、等电点沉淀（次重点） 三、有机溶剂沉淀（次重点） 四、热沉淀 五、其他特殊沉淀方法 一、盐析沉淀 水溶液中蛋白质的溶解度一般在生理离子强度范围内最大，而低于或高于此范围时溶解度均降低 向蛋白质的水溶液逐渐加入电解质，蛋白质吸附盐离子后，带电表层使蛋白质分子间相互排斥，蛋白质与水分子间相互作用加强，蛋白质溶解度增大的现象称为盐溶 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析 （一）盐析沉淀的原理 蛋白质溶液的离子强度增大时，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。 盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。 （二）影响盐析的因素 无机盐（种类、浓度） 温度和pH值 无机盐的种类 在相同的离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同。 离子半径小而带电荷较多的离子盐析效果较好。例如含高价阴离子的盐比一价盐的盐析效果好。 常见阴离子的盐析作用顺序为 PO43－SO42－CHCOO－Cl－NO3－I－ 阳离子的盐析作用顺序为 NH4＋K＋Na+Mg2+ 选择盐析的无机盐时，对盐的其他要求： 溶解度大，能配制高离子强度的盐溶液 溶解度受温度影响较小，便于在低温下进行盐析 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离 温度和pH值 在离子强度较高的溶液中，升高温度蛋白质失水，蛋白质溶解度下降；在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升高而增大。 在pH值接近蛋白质等电点的溶液中，蛋白质的溶解度最小，有利于提高盐析效果。 蛋白质的盐析沉淀操作需选择合适的pH值和温度，使蛋白质的溶解度较小。同时盐析操作条件要温和，不能引起目标蛋白质的变性。盐析需在较低温度下进行。 （三）盐析操作过程 取一部分料液，将其分成等体积的数份，冷却至0℃； 计算饱和度达到20％-100％所需加入的硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中， 0℃继续搅拌1h以上，使沉淀达到平衡； 3000g离心40min，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中蛋白质的总浓度和目标蛋白质的浓度； 分别测定上清液中蛋白质的总浓度和目标蛋白质的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒，检验分析结果的可靠性； 以饱和度为横坐标，上清液 中蛋白质的总浓度和目标蛋 白质的浓度为纵坐标作图。 从图可知，使目标蛋白质不出现沉淀的最大饱和度为35％，使目标蛋白质完全沉淀的最小饱和度为55％。因此，沉淀分级操作应选择的饱和度范围为35％-55％。 具体饱和度值根据同时得到较大纯化倍数和回收率而定。 （四）适用范围及缺点 适用范围：盐析广泛应用于各类蛋白质的初步纯化和浓缩。在某些情况下还可用于蛋白质的高度纯化。 缺点：利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高，一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的分离操作（如离子交换色谱）。 二、等电点沉淀 蛋白质在pH值为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。 利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀。 等电点沉淀的操作条件：低离子强度；pH约等于pI。 等电点沉淀适用于疏水性较大的蛋白质。亲水性很强的蛋白质在水中溶解度较大，等电点pH条件下不易产