神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光.PDFVIP

维普资讯 浙江预防医学 2005年第 17卷第 9期 ZhejiangPrevbled．September VoII7’No．9 · 3 · 神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光 蛋 白基 因转染研究 刘伟 国 冯军峰 杨小锋 郑学胜 【摘要l 目的 探索大 鼠胚胎神经干细胞 (NSCs)的体外培养 ．探讨NSCs作为基因靶细胞，以及逆转录 病毒介导增强型绿色荧光蛋 白 (EGFP)标记NSCs的可行性。方法 胚胎大 鼠脑组织分离神经干细胞 ，无血 清培养 ，免疫组织化学技术鉴定 。用 Lipofectin将pLEGFP—NI逆转录病毒载体导入PA317包装细胞 ，用G418筛 选获得抗性细胞克隆，扩增抗性细胞并收集病毒上清 ；病毒上清感染神经干细胞 ，用G418筛选 ．荧光显微镜 下观察并挑选EGFP表达最强的克隆 ，并做免疫组化鉴定；进一步培养扩增，做传代细胞的分化鉴定。结果 培养出大鼠胚 胎神经干细胞 。荧光显微镜下检测感染逆转录病毒的神经干细胞 ，以及免疫组化鉴定 ，均显 示 EGFP获得 良好表达 ；而且感染细胞能够被诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论 大 鼠胚胎神经干细 胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养 ；神经干细胞可直接作为基 因靶细胞 ；利用逆转录病毒载体 ，建立 稳定表达EGFP的神经干细胞系具有可行性 ，为进一步做标记细胞移植研究奠定基础。 【关键词1神经干细胞；增强型绿色荧光蛋白；逆转录病毒载体 中图分类号：R一33 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—0931(2005)09—0003-03 A Studyon Culture ofNeuralStem Cellsin vitroand Transfection ofEnhanced Green Fluorescent Protein 删 Wei-~ ，FENGJun-feng，YANGXiao-feng，eto2．( SecondAffiliatedHospita1．zhejia,~ UniversitySchoolof 出妇 ， 咖 “，zheji~g，310009．China．) 【AbstractlObjective Toexplorethecultureofneuralstemcells(NSCs)invitroandthefeasibilityofNSCsbeinggene targetcellsandenhnaced eenfluorescentprotein(EGFP)labelingNSCs．Methods TheNSCswel~isolatefromratembryo brains．then cultured in csram freemedium，and identifiedby immunocytocbemistry．pLEGFP-N1retroviralvec0【rswere transferredintoPA317cellsbylipofectin．AfterselectedbyG418．theresistantcolonieswere cloned，andhtevirussupematant wascollcetde ．TheNSCswere infectde byhtevirussupernatant，and htenselectedbyG418．Th ecolonieswiht thebest expression ofEGFP were obesrvde and selceted usingfluorescencemicmesope，and identifiedwith immunocytochemistry technology，whichwere furtherclonde and theirpassagecellswere alos identified with immunocytochemistry tcehnoloyg ． Results TheNSCswere successfullyculturde nadG418resistantclonesofNSCsgaveoffstrikinglybrightgreenfluorescence． 1heEGFP expressde well，a