第3篇高效液相色谱.ppt

第3章高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography, HPLC 3-1 高效液相色谱法概述 高效液相色谱与其他仪器相比特点： （1）高压 （2）高速 （3）高效 （4）高灵敏度 高效液相色谱法概述 经典的液相色谱法与现代液相色谱法的比较 1.流动相的输送形式不同。 2.分析周期不同。 3.柱效不同。 液相色谱与气相色谱的比较 相同点：液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。 根据保留值定性、根据峰高或峰面积定量。 不同点： （1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。 液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析。 （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程。 液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大； 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。 （3）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。 3-2 影响液相色谱柱的因素 1. 涡流扩散项He He=2λdp dp:固定相平均颗粒直径，λ为固定相的填充不均匀因子。 使用细小的颗粒，填充均匀，可减小涡流扩散项。 纵向扩散项Hd Hd=CdDm/u 分子在液体中的扩散系数比在气体中小4~5 个数量级，对色谱峰扩散的影响可忽略。 传质阻力项 固定相传质阻力项和流动相传质阻力项 H＝(Csdf2/Ds+Cmdp2/Dm+Csmdp2/Dm)u 是影响柱效能的主要因素，固定相颗粒越 小，H越小 3-3 高效液相色谱法的主要类型 及其分离原理 按分离机理不同分为：液液分配色谱、液固色谱、离子交换色谱、离子对色谱、离子对色谱、离子色谱法和空间排阻色谱 分离系统由两相—固定相和流动相组成 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。 根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 液液分配色谱法 在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，保留值小，先流出柱。 正相液液色谱法(Normal phase Chromatography)：流动相极性小于固定相极性，又称为正相洗脱或正相冲洗。 极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱，适合于分离极性化合物。 反相液液色谱法(Reversed phase Chromatography)：流动相极性大于固定相极性，又称为反相洗脱或反相冲洗。 极性小的后流出色谱柱，极性大的先流出色谱柱，适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。 正相色谱固定相：硅胶、三氧化铝以及载有醇基、氨基和氰基的固定相。流动相选用非极性流动相，如：正已烷或环已烷 正相色谱依据溶剂极性差别达到分离目的。 反相色谱固定相：非极性载体。固定相以硅胶为基质，将不同疏水基团通过化学键合到硅胶表面的游离羟基上（如键合C18烷基的非极性固定相，为C18柱） 大多数有机化合物都存在疏水基团，因此，反相色谱较为普遍。 液—固吸附色谱法 液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离。 吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。 一、液固色谱法固定相 酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁 碱性吸附剂：氧化铝 氧化镁 流动相：液体 固定相：吸附剂（主要是多孔物质，如硅胶、氧化铝、硅藻土等） 适合分离中等相对分子质量（200＜M＜2000），能溶于非极性或中等极性溶剂的脂溶性样品的分离。凡能在薄层上成功分离的化