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小鼠破骨细胞分离培养及鉴定 　　摘要 选择小鼠为试验对象，观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。采用小鼠共培养试验，结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明：利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞，TRAP染色阳性，能在骨片表面形成吸收陷窝。提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。 　　关键词 破骨细胞；TRAP染色；骨吸收陷窝；小鼠 　　中图分类号 R-332 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）18-0251-03 　　骨疾病的发生与骨形成、骨吸收失衡有关，骨吸收大于骨形成导致骨量减少，而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关[1]。从破骨细胞着手揭示骨吸收机制，为许多由破骨细胞引起的疾病如绝经后的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶解以及矫形外科中的植入体的丢失等提供防治依据。与此相关，分离成熟的破骨细胞对于研究破骨细胞的特征、功能和调节来说显然是一种必不可缺少的工具。该研究以小鼠为试验对象，建立小鼠共培养试验培养破骨细胞的方法，来获得具有特征性的破骨细胞。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 试验动物。1日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。 　　1.1.2 主要试剂及仪器。α-MEM，胎牛血清，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒、1，25-（OH）2D3，甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片。YJ2875B型医用净化工作台，P纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱，超声清洗仪，XSZ-D2倒置显微镜，XL30-ESEM环境扫描电子显微镜[2-3]。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 成骨细胞分离培养。将1日龄的小鼠浸入75%酒精浸泡3～5 min。无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL离心管，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃气浴摇床消化20 min，80 r/min，弃胰酶。用PBS冲洗并尽量吹打以除去成纤维细胞。将骨片剪成糊状，加入0.1%Ⅱ型胶原酶3 mL，置气浴恒温振荡器内80 r/min、37 ℃振荡消化1 h[2-3]。将头盖骨转入1.5 mL指形管中，用剪刀剪碎，直至剪成糊状（需时30 min），混匀转入50 mL离心管，封口，37 ℃气浴摇床消化60 min，80 r/min；转入离心管用PBS洗涤然后转入15 mL离心管，离心10 min，1 500 r/min。弃去上清，再反复用PBS吹打洗涤离心2次，1 000 r/min，5 min。弃去上清，沉淀即为成骨细胞（OB），加入3 mL完全D-MEM重悬，吹打均匀，再加入3 mL完全D-MEM重悬，吹打均匀静置20 s后取上悬液接种于培养瓶中，37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养。24 h后换液，以去除骨碎片和未贴壁的组织块、细胞。之后每隔48 h换液1次，5～7 d后生长良好。 　　1.2.2 骨髓细胞分离。参阅国内外文献[4-6]，分离3只3月龄大的小鼠的胫骨和股骨，取25号针头，用HBSS+10%胎牛血清将骨髓吹出。先用19号针，再用25号针将细胞吹碎得到细胞悬液。通过ficoll将红细胞移去（600 g，25 min，刹闸关闭），收取细胞后用HBSS清洗1遍，用1 mL培养基悬浮细胞保持细胞在冰上。 　　1.2.3 共培养操作。每一板中骨髓细胞的数量和成骨细胞的最适数量是不同的。这个最适数量要考虑小鼠的品种，例如采用的是MF1小鼠，则其破骨细胞最适的密度为：在96孔培养板中，每孔添加100 μL培养基+10 nmol/L VD3+8×103成骨细胞，为防止溶液的蒸发，边孔不添加细胞，但应填满水。在第1天，每个孔添加50 μL 2×105个新鲜分离的骨髓细胞，培养基中应该含有10 nmol/L VD3。在第6天，重新换50%新鲜的培养基，方法如下：①每孔添加150 μL含有20 nmol/L VD3的新鲜培养基；②让细胞沉降15 min；③然后每孔再移掉150 μL。在第10天的时候，进行固定和染色。重新换液需要非常谨慎，因为成骨细胞层很容易受到干扰，脱落，这会导致破骨细胞数量的减少。通常情况下，出现第1个破骨细胞一般在第6天，适量的破骨细胞的出现一般在第7～10天。 　　1.2.4 TRAP染色。取培养24 h的玻片，置于2.5%戊二醛中在4 ℃条件下固定10 min，用蒸馏水冲洗干净后，浸入孵育液中，在37 ℃条件下避光水浴1 h，然后置于光镜下进行细致观察[2-3]。 　　1.2.5 破骨细胞形态学观察。倒置显微镜观察细胞的形态、生长及贴壁情况。 　　1.2.6 破骨细