溶血和脂血两种因素对HBV―DNA实时荧光定量PCR方法的影响.docVIP

溶血和脂血两种因素对HBV―DNA实时荧光定量PCR方法的影响 　　【摘要】 目的：探讨溶血和脂血这两种因素对HBV-DNA实时荧光定量PCR方法的影响。方法：（1）收集HBV-DNA标本，并依据其浓度划分为Ⅰ水平和Ⅱ水平；需收集HBV-DNA呈阴性、重度的乳糜状脂血标本和正常人标本。把所收集的标本按不同的比例行混合，以制作成极高TG浓度却不同HBV-DNA水平的AⅠ以及AⅡ组；而高TG浓度却不同HBV-DNA水平的BⅠ以及BⅡ组；正常TG浓度HBV-DNA水平却不同的CⅠ以及CⅡ组。而实时荧光定量PCR则呈扩增趋势。（2）收集HBV-DNA标本，每人共需采集3份标本，然后将其中的2份标本在-20 ℃条件下进行冷冻，但是冷冻的时间则不同，然后把所得标本制作成重度溶血DⅠ以及DⅡ组；中度溶血EⅠ组以及EⅡ组；无溶血对照组FⅠ组以及FⅡ组。（3）使用方差对各个检测结果进行分析。结果：浓度不同的脂血和溶血对两种水平的HBV-DNA荧光定量PCR的相关检测结果的影响程度相比，比较差异均无统计学的意义（P0.05）。结论：溶血和脂血对实时荧光定量PCR检测HBV-DNA均无明显的影响 【关键词】 溶血； 脂血； HBV-DNA； 实时荧光定量PCR 中图分类号 R44 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2015）6-0058-02 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2015.06.029 临床诊治中所采集的标本是多种多样的，其中主要有脓液、痰、血清、血浆和脑脊液以及各种分泌物等[1]。在临床上，同类型标本的相关性质也可以多种多样，比如，血清标本可分为程度各异的溶血和脂血标本[2]。本研究借助于实时荧光定量PCR方法对程度各异的脂血和溶血标本中的HBV-DNA行全面检测，旨在探讨溶血和脂血这两种因素对HBV-DNA实时荧光定量PCR方法的影响，取得了理想的效果，现报道如下 1 资料与方法 1.1 仪器与试剂 本研究中PCR扩增仪的型号是LightCycler480；而梯度PCR仪的型号则为ABIVeriti；选取安徽达安基因公司生产的HBV-DNA试剂，产品批号为2010005；选用日立760全自动化的生化仪和紫外可见光度计[3]。选用浙江利康生物科技公司生产的三酰甘油（TG）生化试剂，该产品的批号 1.2 标本的采集方法 1.2.1 乳糜状的脂血因素相关标本 从2012年8月-2014年8月来笔者所在医院体检的健康人员中选取30例正常血脂并且无溶血的HBV-DNA血标本，每例均采集3 ml血液。依据标本中的HBV-DNA的浓度把30例血标本共划分成两个水平：（1）中高HBV-DNA浓度（即HBV-DNA在1.0×105 copies/ml以上），标本共15例，将其设定成Ⅰ水平；（2）HBV-DNA临界浓度（即HBV-DNA为1.0×103～1.0×104 copies/ml），标本共15例，并将其设定成Ⅱ水平。然后收集乙肝表面抗体呈现阳性或两对半全阴性并且肝功能正常且无溶血的重度的乳糜状脂血标本以及正常的血清标本，均为5例，每例采集3 ml血液，将血清及时地进行分离，然后在-20 ℃ 的条件下进行保存 1.2.2 溶血因素相关标本 收集30例乙肝患者的无脂血或黄疸血的标本，每例采集3管，每管需3 ml，然后把其中的两管在-20 ℃的冷冻条件下进行保存，由于不同的冷冻时间可得到不同程度的溶血，因此可将其留做平行实验[4-6] 1.3 方法 1.3.1 设计实验步骤及方法 采集不同血脂浓度和溶血程度的标本，然后分析溶血和脂血两种因素对由PCR扩增仪所测定的两个水平的HBV-DNA的检测结果的影响 1.3.2 制作标本的方法 1.3.2.1 制作两种水平HBV-DNA且TG浓度不同的标本的方法 （1）根据HBV-DNA浓度把所收集的标本可划分成两个水平：①中高HBV-DNA浓度（即HBV-DNA 在1.0×105 copies/ml以上），标本共15例，将其设定成Ⅰ水平；②HBV-DNA临界浓度（即HBV-DNA为1.0×103～1.0×104 copies/ml），标本共15例，并将其设定成Ⅱ水平；（2）在结合本实验具体情况的基础上，依据我国胆固醇治疗专家小组所规定的血脂标准而制作出3种TG浓度的标本：①A组，也即极高TG浓度的脂血，TG在5.63 mmol/L以上；②B组：也即高TG浓度，TG为2.24～5.65 mmol/L；③C组：正常的血脂浓度的标本；（3）混匀所收集的重度的乳糜状的脂血标本后进行TG的相关检测，TG为13.88 mmol/L；（4）Ⅰ/Ⅱ水平HBV-DNA的TG浓度不同的标本采集及制作方法，A