消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响_0.docVIP

消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响 消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响 结肠癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在男性和女性中分别位居第3位和第2位，且有逐年上升趋势[1]。 　　结肠癌属中医学肠蕈范畴，多因饮食失节、脾胃受损、湿热壅聚成痰而搏结肠腑所致。消痰通腑方为魏品康教授从痰论治消化道肿瘤核心治则消痰散结八法之一。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一类可催化脂肪酸水解并产生以花生四烯酸（arachidonic acid，AA）为主的游离脂肪酸酶，具有产生炎性介质、参与细胞信号转导等多种功能，在人类肿瘤发生、发展中发挥重要生物效应[2]。环氧化酶（cyclooxygenase，COX）是PLA2催化AA生成生物活性分子的限速酶，包括COX-1和COX-2。研究表明，COX-2在结肠中过度表达，其与细胞增殖、分化等有关[3]。本研究采用消痰通腑方干预结肠癌SW480细胞，观察其对细胞增殖、迁移的影响，探讨其分子作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞株 　　人结肠癌SW480细胞，中国科学院上海细胞库。 　　1.2 药物及制备 　　消痰通腑方由制半夏、制南星、大黄、陈皮、鸡内金、炙甘草组成，所有饮片由上海雷允上药业有限公司提供。消痰通腑方由第二军医大学试剂中心制备，按比例（制半夏15 g，制南星15 g，大黄6 g，陈皮15 g，鸡内金15 g，炙甘草6 g）称取10倍量的饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮2次，每次1 h，将煎液合并后离心、浓缩、干燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率为1 g原药材/0.26 g。等比例换算至药物浓度分别为2.24、8.96 g/mL。实验前称取适量醇提物干粉，经涡旋、超声、水浴等方法使其充分溶解于DMEM培养基后，0.22 m滤器过滤并配置成所需浓度的溶液，4 冰箱贮存备用。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　DMEM培养基，胎牛血清（FBS），0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液，qPCR、cDNA反转录、总RNA提取试剂盒，transwell小室，CCK8溶液，PLA2抗体，COX-2抗体，PLA2 shRNA质粒，shRNA对照质粒，shRNA质粒转染试剂，均购自Santa cruz公司。 　　超净工作台（广州深华生物技术有限公司），CO2培养箱、BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），LXJ-A型离心机（上海安亭科学仪器厂），GE4852 型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），DYCZ-24DN电泳仪（北京六一仪器厂），Tocan500全自动凝胶成像系统（南京裴尔森生物科技有限公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 细胞培养及药物干预 　　结肠癌SW480细胞常规培养于含10%FBS和1%青-链霉素双抗DMEM培养基，每隔1～2 d换液，待细胞融合约80%时进行细胞传代及种板。消痰通腑方原药材浓度为8.96 g/mL，经0.22 m无菌过滤器过滤，用培养基稀释成实验所需浓度。实验根据药物浓度分为对照组（0 g/mL）、低剂量组（2.24 g/mL）、高剂量组（8.96 g/mL）。 　　2.2 CCK-8法检测 　　取对数生长期上述3组细胞，经胰酶消化后，接种于96孔板，每孔细胞数为1103。每组设5个复孔。分别于24、48、72、96、120 h后加10 L CCK-8溶液。置于培养箱培养4 h，于酶标仪波长450 nm处测定细胞吸光度（A）值，计算细胞相对增殖率[（实验组A值-对照组A值）对照组A值100%]。 　　2.3 平板克隆形成实验 　　取对数生长SW480细胞悬液梯度倍比稀释后，接种于6孔板中，每孔50个细胞。置于培养箱内培养24 h，各组分别加入各浓度消痰通腑方溶液，重新置于培养箱中，经常观察，当出现肉眼可见克隆时，弃去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定15 min后加Gimesa染液染色。计算克隆细胞数目。实验重复3次，取其平均值。 　　2.4 Transwell小室实验 　　收集3组细胞，800 r/min离心5 min，PBS清洗2次，用培养基重悬并调整细胞浓度为1109/L。分别取100 L细胞液置于Transwell小室上层，同时在下层加500 L DMEM培养基。37 培养箱中培养48 h，擦净小室滤膜上层的细胞。4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗并用结晶紫染色。每组同时做3个重复小室，200倍显微镜下计数并拍照。 2.5 RT-qPCR检测结肠癌SW480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2 mRNA表达 　　从Gene Bank网站获取PLA2、COX-2基因序列，并使用Premier5.