cell培养经验概述.doc

[【实验交流】] 组织细胞培养技术（总结）上 组织细胞培养技术 组织培养细胞生物学一、体内外细胞的差异 “反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。二、培养细胞的分化1、不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）2、脱分化或去分化（Dedifferentiation):细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉储存肝糖原能力）培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。培养细胞的形态分类：分为贴附型和悬浮型两大类（一）贴附型 1、成纤维型细胞：心肌细胞、平滑肌、血管内皮细胞等 2、上皮型细胞? ? 3、游走型细胞? ? 4、多形型细胞培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命期：原代培养期 传代期 衰退期原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。无限细胞系： 细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.（二）组织培养细胞一代生存期1、潜伏期（Latent phase) :细胞从悬浮状态贴附于底物表面上。原代培养细胞贴附慢 （10-24 h）。连续细胞系贴附快（10-30 min)。细胞贴附受多种因素影响（1）支持物：底物表面要清洁， 底物表面有阳性电荷有利于细胞贴壁。（2）一些特殊物质的存在：血清2 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.3、停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖。培养细胞生存环境、条件和代谢一、无污染环境? ?二、温度：? ? 三、气体环境和pH培养细胞生存所需基本物质：1、糖??2、氨基酸??3、各种维生素? ? ? ? 4、促生长因子* ：血清*? ???5、其他物质五、渗透压附着底物：1、玻璃2、一次性聚氯乙烯材料3、饲细胞（Feeder cell)用成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢功能。将特殊难培养的细胞接种于其上。体外培养细胞成功率分析成功的关键:培养物必须贴附在底物上细胞生长和增殖一、组织和细胞的供体年龄二、培养条件三、贴附底物四、培养方法：酶消化分离 培养用液平衡盐溶液（Balanced Salt Solution,BSS)天然培养基(Natural Medium)合成培养基(Synthetic Medium)Hanks’ 平衡盐溶液（Hanks’ Balanced Salt Solutions，HBSS）成分 含量（g/L）CaCl2 (无水氯化钙) 0.14? ?? ?KCl 0.40? ?? ?? ?? ?? ?KH2PO4 0.06MgCl2·6H2O 0.10? ?? ?? ?? ?MgSO4·7H2O 0.10? ?? ?NaCl 8.00NaCO3 0.35? ?? ?? ?? ?? ???Na2HPO4 0.048? ?? ???D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用D-Hanks 天然培养基血清 细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清.。血清内含有多种促细胞生长因子，促贴壁因子及其它活性物质等。一般需加10%-20%热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量 合成培养基一、种类RPMI1640：适用于很多细胞的生长，特别是血液细胞。DMEM（Dulbecco’minimum essential medium) (高糖和低糖）低糖对肿瘤细胞有力。HamF12 和Mc-Coy5A 多用于难培养