神经干细胞体外培训技术.pdf

神经干细胞体外培养与鉴定 一 前 言 神经干细胞(Neural stem cells, NSC )是神经系统内能产生神经元和胶质细 S 胞的未分化原始细胞【1-2】。文献报道，NSC 具有无限增殖、自我更新和多向分 化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5 】。此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。 根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC 分化成宿主细胞来 替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8 】。 基于 NSC 的上述特性，从而奠定了NSC 在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而 如何获取 NSC 则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。本实验拟建立 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP ）转基因小鼠NSCs 原代和传代培 养技术，为后面的实验提供方法支持。 二 实验所需仪器、试剂及其配制 （一） 实验仪器 光学显微镜 （Olympus,Japan ） 倒置荧光显微镜 （LEICA DMIRB ） 冰冻切片机 （Leica CM1900 ，Germany ） 光明 DZKW 型电热恒温水浴锅 （北京市光明医疗仪器厂） XK96-A 快速混匀器 （姜堰市新康医疗器械有限公司） HT-200 电子天平 （成都普瑞逊电子有限公司川制） FA1004 型精密电子天平 (上海良平仪器仪表有限公司) MP 8001 单臂脑立体定位仪 (深圳市瑞沃德科技有限公司) 10μl 微量进样器 （Pressure-Lok ，PRECISION SAMPLING CORP ， BATON ROUGE ， LOUISIANA ，Made in USA ） 0.5ml、1ml Eppendorff 管 （Ependorff ） 手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄 刀片等。 1 （二） 试剂 1. DMEM/F12，Hanks 液（Hyclone ），N2 （Gibico ），bFGF （Invitrogen ）。 2. 碳酸氢钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钾，氯化钠， 多聚甲醛等为国产分析纯试剂，谷氨酰胺，青霉素，链霉素。 （三） 主要试剂的配制 1. 基础培养基DMEM/F12 1:1 的配制 DMEM 粉剂 1.34g ，F12 1.06g 。 （1）称取以上试剂量后放入200ml 烧杯中。 （2 ）加三蒸水至200ml 搅拌溶解。 （3 ）用 1mol/LNaOH 或 1mol/LHCl 调 pH 值为 7.20 。 （4 ）过滤分装，置4 ℃冰箱保存。 2. D-Hanks液（g/L ）的配制 KCl 0.40g ，KH PO 0.06g ，NaCl 8.00