CHO细胞表达系统.doc

CHO细胞表达系统原理 分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。本文就 CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。 CHO细胞表达体系及其特点 , _4 p9 [( N y0 G6 h+ f C* l4 n? ??诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。3 K4 F: U- z* K( L! x! t. d) v+ N? ??基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。; |7 z# U) f. @8 j/ ?? ??针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：- X$ Y$ l8 i$ _2 n# m? ?? ???①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；- F2 A) q- S( t/ }9 Z- x? ?? ???②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； ? ?? ???③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ? ?? ???④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；% U0 e! v z6 q( ]0 m/ }# b- J? ?? ???⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。+ S5 a8 ?8 E d# b 但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中加入转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：! _- y2 N4 ]! h+ X5 k. G( q3 | K z? ?? ???(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ! z: m/ s2 N2 y2 n s% e? ?? ???(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； ???(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；5 X+ z4 n5 O9 r% (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； ???(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 * Q# s; G2 ]3 S/ H- `表1 用于生产基因工程药物的表达系统. 表达系统5 特点1 j 产量2 原核* h4 P0 ] k$ p; |生物4 ~% j2 d9 I/ N* H! D! l P 大肠杆菌(E.coli)3 e4 e2 n1 O??s- j I- r8 B 具有原核细胞良好的可操作性，成本低．产率高，但不能进行糖基化修饰，胞内分泌形成包涵体。. m/ l9 E6 g5 q0 Q; W) C: Q2 p { 外源蛋白占细菌总蛋白量：胞内表达10%~70%，胞外表达 0.3~4％( I0 `$ e( K9 n C+ Z7 c 真