细胞免疫染色及畸胎瘤切片的制作流程201204.pptVIP

畸胎瘤的获得 畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲 流程 脱蜡亲水 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 100% EtOH浸泡2次 10min/次 95% EtOH 5min 90% EtOH 5min 80% EtOH 5min 70% EtOH 5min 蒸馏水浸洗3次， 5min/次 Xylene1 Xylene3 Xylene2 Xylene4 脱蜡 亲水 （非一次性使用，可反复多次使用） 二甲苯浸泡4次 5min/次 流程 染色 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色，此步骤称为“盐酸分化” (1%盐酸酒精溶液：指染色缸中70％酒精中含1%盐酸) 将切片 在自来水龙头下流水冲洗15-20分钟，至切片呈理想的紫蓝色，此步骤称“蓝化” （颜色的适宜度取决于染色者的经验） 蒸馏水中涮洗一下 切片在Eosin溶液中染5min 自来水涮洗至水接近无色 蒸馏水涮洗一下 切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡 10min 自来水中涮洗2、3次至水接近无色 蒸馏水中涮洗1次 流程 脱水封片 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 100% EtOH浸泡2次 10min/次 脱水 二甲苯浸泡4次 5min/次 Xylene1 Xylene3 Xylene2 Xylene4 透明 （非一次性使用，可反复多次使用） 70% EtOH short time 80% EtOH short time 90% EtOH short time 树脂封片，显微镜下观察 (以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余的Eosin颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。70％和80％的酒精只要稍稍浸一下即可，90％的酒精是调整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用) 流程 畸胎瘤石蜡切片的制备 在样品中央滴一滴封片树脂 固定 包埋 切片 捞片、展片 封片 封片树脂 避免气泡 通风橱内操作为宜！ 末端蘸有少量二甲苯的盖玻片 畸胎瘤的获得 畸胎瘤石蜡切片的制备 畸胎瘤石蜡切片的HE染色 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 分化良好的畸胎瘤 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 外胚层 神经上皮 色素上皮 角质上皮 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 中胚层 脂肪组织 肌肉组织 软骨组织 骨组织 畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 内胚层 呼吸上皮 腺体组织 原始肾脏组织 多能干细胞免疫染色及畸胎瘤石蜡切片的制作流程 成璐 复旦大学 生物医学研究院 第一部分 多能干细胞免疫染色过程 铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照 提纲 铺细胞 ES细胞或iPS细胞的密度要求 无滋养层细胞较好 传代后至克隆形态良好，密度适中。 通常传至24孔板中。 因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。 Oct4/DAPI 铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照 提纲 材料 细胞的固定 流程 把细胞固定在4％PFA中，室温放置30min 4％多聚甲醛（4％PFA, Paraformaldehyde） 固定细胞之前，将培养基吸弃，用PBS涮2次 0.1M的PBS配制（PH7.4），100mL PBS加4克多聚甲醛。 由于多聚甲醛难溶于水，需用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下。 铺细胞 细胞的固定 细胞的荧光染色 观察荧光染色并拍照 提纲 细胞的荧光染色 材料 流程 阳性染色对照：染色呈阴性时，证实染色的有效性 阴性染色对照：染色呈阳性时，证实染色的特异性 一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核 抗体稀释液：稀释抗体 封闭液：封闭非特异性反应 洗涤细胞 透膜（仅限染核抗体） 一抗孵育 二抗孵育 染核定位（Hochest） 细胞的荧光染色 材料 阳性染色对照：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如ES细胞或经过验证的iPS细胞 阴性染色对照：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。 一抗：要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度 二抗：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。 Hoechst：英文名称：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分装后于-20℃保存；常用的可置于4 ℃ ，染色时以1XPBS 1000倍稀释。 抗体稀释液：0