iCycleriQ荧光定量PCR仪的操作程序.docVIP

iCycler 荧光定量PCR仪的操作程序 接通iCycler的电源，实验前先让系统预热30分钟。打开电脑，启动iCycler的软件，并点击Yes和OK注册登陆。 在0.2ml的薄壁PCR反应管内加入PCR反应试剂和待测样本，并盖上盖子。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 在Protocol Workshop模块中设置PCR热循环的程序（thermal protocol），包括温度、时间、循环次数等参数的设置。（详见说明书5.1。） 在Protocol Workshop模块中设置反应板设置文件（Plate Setup）。在设置窗口的96孔模拟布局图中选择本次实验使用哪些孔、样品类型（sample type）以及要检测的荧光基团种类。如果样品类型是标准品的话，还要输入其对应的量。全部完成后再点击“View Plate Setup”键，进行确认。（详见说明书5.2。） 确认上一步中选择的滤光镜组是否就位。（详见5.2.5。）完成后按“Run”键。 随后系统自动切换到 “Run Prep”窗口，用户在此确认PCR热循环文件和反应板设置文件是否正确。在“Sample volume is”文件框中输入反应体系的体积；根据本次实验内容在“Identify Protocol Analysis”中选择PCR定量/熔点曲线（PCR Quantification/ Melt Curve）；在“Well Factor Source”中选择使用反应板内部矫正（Experimental Plate）。一切都完成后点击“Begin Run”键。 给本次的数据记录文件（opd文件）起名。 PCR循环开始后，系统会打开Run-Time Central模块对实验进行实时监控。当实验进行到荧光收集循环时，Data Analysis模块会自动打开，进行数据的收集和分析。 在实验结束后，在PCR Quantification窗口的“Anlysis Mode”文件框中选择“PCR Base Line Subtracted” 模式选项可得到各样品的Ct值。点击窗口上方的“PCR Standard Curve”窗口选择切换键进入PCR Standard Curve窗口，可得到本次实验的标准曲线。在标准曲线图下方的表格中显示着与其相关的数据，内容包括样品序号、样品类型（Type）、Ct值（Threshold Cycle）、起始模板量（Starting Quanity）等。 实验结束后关闭iCycler软件，光学及扩增系统电源，关闭电脑。