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神经元的高尔基染色方法（protocol ） 针对神经元的Golgi-Cox 染色方案和处理 制作人：Tracey Wheeler （George Mason Univesity ） 1. 配置高尔基溶液（1L 容量） A 溶液：5%重铬酸钾溶液——重铬酸钾5g+蒸馏水200ml （最好在通风的情况下，用玻璃棒 在烧杯中搅拌均匀）。 B 溶液：5%升汞——升汞 10g+蒸馏水200ml （最好在通风的条件下，用玻璃棒在烧杯中不 断搅拌，适合加热直至溶解。 C 溶液：5%铬酸钾溶液——铬酸钾8g+蒸馏水 160ml （最好在通风情况下，用玻璃棒在烧杯 中搅拌均匀）。 将A 溶液和B 溶液倒入500ml 烧杯中搅拌均匀，C 溶液倒入 1000ml 烧杯中，用400ml 蒸馏水稀释，在不断搅拌中缓慢将A、B 混合溶液倒入 C 溶液中，保存在带有棉花塞子的 玻璃瓶中熟化5 天（黑暗中）。 备注：根据下面的比率以及需要配置溶液的量加以配置 5 体积的5%重铬酸钾 5 体积的5%升汞 4 体积的5%铬酸钾 10 体积的蒸馏水加入C 溶液中 2. 将高尔基同业转入小玻璃瓶中 用塑料吸管从大玻璃瓶中吸取高尔基溶液（尽量避免吸入红色沉淀物）放入小玻璃瓶中， 大约为整瓶体积的3/4 （剩下的容积足够容纳一只动物大脑）。 3. 用盐水注射技术处死动物 动物麻醉后，绑在空饲养盒子上（可以让血流入盒子中），打开胸腔暴露心脏，将0.9% 盐水60ml 注入右侧心室底部（即动物的左心室），剪开左侧，心室底部（即动物的右心 室），缓慢注入盐水，直至左侧的心室的血液全部消除（可能需要注射三次），断头取脑， 放入配置好的高尔基溶液中，在黑暗中储存 14 天，2 天后更换新鲜高尔基溶液。 4. 将脑组织转入蔗糖溶液中 蔗糖溶液：300g 蔗糖+1000ml 蒸馏水（用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适当加热直至溶解）， 然后放入冰箱中冷藏（一旦变冷即可使用） 倒掉高尔基溶液，将脑组织在滤纸上轻轻吸干，用蒸馏水冲洗广口瓶，放入3/4 蔗糖溶 液（有足够空间容纳脑组织），然后将脑组织放入广口瓶中（脑组织会漂浮起来），放入冰箱 储存。脑组织一旦下沉，就可以准备切片。 5. 使用振动切片机切片 将刀片在二甲苯中浸泡5min 去除油脂后（在通风条件下），取出擦干。配制6% 的蔗糖 溶液（蔗糖6g+100ml 蒸馏水），在室温和低于室温下保存。将6%蔗糖溶液倒入振动切 片机的储存室直至刀片被覆盖。将脑组织（直到整个大脑的1/2）用强力胶固定在振动切片 机的平台上（需要 5~7min 或更长时间，以确保组织在切片上被粘牢）。然后将粘有脑组织 的平台插入储存室。将切片机的速度和幅度均调至中点（可根据不同的仪器和安全要求进行 操作），在200μm 或需要的厚度处切片（超过400μm 的切片分析有困难）。用小画笔将切片 移动到明胶化的玻璃片上。用石蜡膜覆盖组织。玻片比较平的一面用吸水海绵覆盖，石蜡膜 一侧也用吸水海绵覆盖，用手掌轻轻压，尽量不要移动位置（目的是将组织切片压在玻片的 明胶上，在染色过程中能够粘附在玻片上），取掉海绵纸将玻片在湿润的环境中。 6. 染色 配置新鲜的溶液（足够覆盖所有玻片） 蒸馏水（3 体积） 氨水（1 体积，在通风环境下） 柯达固定液（1 体积，在通风条件下，黑暗中） 50%乙醇（1 体积） 70%乙醇（1 体积） 95%乙醇（1 体积） 100%乙醇（3 体积） CXA 溶液（1 体积） 柯达固定液：将所有成分放在烧杯中，按顺序混合（避光） 加 1010ml 蒸馏水，加251ml 柯达固定液A，加28ml 柯达固定液B，加2020ml 蒸馏水。（可 根据需要每次配 1/2 或 1/3） CXA 溶液：1000ml 氯仿+1000ml 二甲苯+1000ml 乙醇（可根据需要每次配1/2 或 1/3，必 要的话揭掉玻片上的石蜡膜，将玻片放入玻璃托盘通过以下环节染色 ⑴用蒸馏水冲洗 1min ⑵氢氧化铵溶液中浸泡30min （黑暗中） ⑶用蒸馏水冲洗 1min ⑷柯达固定液浸泡30min （黑暗中） ⑸用蒸馏水冲洗 1min （只要在水中就可以开灯） ⑹用50% 乙醇脱水1min ⑺用70% 乙醇脱水1min ⑻用95% 乙醇脱水1min ⑼用 100%乙醇脱水5min ⑽用 100%乙醇脱水5min ⑾用 100%乙醇脱水5min ⑿在C