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分子生物学实验小技巧 主要内容 1.SDS.双向电泳 3.质粒提取 4.Western Blot 5.溶液配制 6.PCR、酶切、连接并进行凝胶检测 7.RNA提取与检测 8.其他 SDS 1.? ?? ? SDS配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积（如100ml）预制胶，储存在4度冰箱（注：10% APS，TEMED不加），每次配置时只需吸取所需体积的预制胶加入相应体积APS，TEMED即可，预制胶可储存半年以上，能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。。 2.? ?? ? 配胶过程中，普通的SDS中加入约13%的甘油，可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成60%的甘油即可。。 3.? ?? ? 胶配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放4度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下梳子即可使用。 4.? ?? ? 分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇（浓度无要求，干净即可），效果较好。 5.? ?? ? 配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入4℃以降低凝聚速度，而将凝胶放入37度促聚，并随时用4℃加剩的胶补充下降的胶面；另外将胶横放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响。 6.? ?? ? 丙烯酰胺放置时间过长（超过一年），会吸水潮解，导致胶不凝。。 7.? ?? ? 凝胶时温度高凝胶快，但过高时，会影响交连物的孔径大小，25℃为宜。 8.? ?? ? 氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。。 9.? ?? ? 大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用8M尿素重悬细胞后再煮效果较好。 10.? ?配好的10×TBE经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且跑出的条带也很漂亮。 11.? ?上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液补全，这样跑出的胶较为一致。所有的加样孔都加样，可以防止边缘的样品拖尾，如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。 12.? ?跑胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。。 13.? ?跑胶过程中，为节省时间，可以提高电压，但得注意散热，可以冰浴跑胶，将电泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，节省的时间的同时，效果也较好。。 14.? ?防止条带跑歪：分离胶配好后4度过夜；在点样的时候紧靠于上样两边的点样孔各上20微上样缓冲液。 15.? ?电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处（也就是凝胶部分），一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。。 16.? ?染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热5-10秒，不能太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是旧染色液，隔十分钟加热一次。。 17.? ?脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次即可。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。。 18.? ?用硝酸银染色，那么显色时如果迟迟不出现条带，可以再显色夜里加一点甲醛。如果染色或显色没有做好，染成了海带胶，我们可以复染。将胶用一蒸水清洗7.8遍，再重新染色，显色。 19.? ?脱色时用0.25M NaCl代替脱色液，效果较好，无毒。。 20.? ?脱色时，在脱色液中加入娄张捏成条状的擦镜纸或是面巾纸，由于染料吸附到纸纤维上，可以加速脱色，待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。。 双向电泳 1.? ?? ? 向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。 2.? ?? ? 一向电泳时，盐离子容易聚在胶槽的两侧，剪一小段IPG胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了，避免一向电泳不好影响最后实验结果。。 3.? ?? ? 在做第一相等电聚焦分离的时候，如果空气湿度大，除湿很重要（可通过空调或除湿机），要不等电聚焦仪起的镀金电极会因为冷凝在上面的水汽产生电火花而烧坏。。 ?? 质粒提取 1.? ?? ? 质粒提取时，最后一步的酒精挥发对后续