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动物细胞培养及观察的讨论 李琼 222009317011080 我们这组做的事hela细胞的培养，通过这个实验我做了以下几点分析： 一、血清 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，具有极为重要的功能。 （1）牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖宫产的胎牛；新牛血清取自出生24 h之内的新生牛；小牛血清取自出生 10－30 d的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 （2）血清的主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，主要有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。 （3）血清主要作用： ①提供基本营养物质 氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。 ②提供激素和各种生长因子 胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因于、血小板生长因子等。 ③提供结合蛋白 结合蛋白作用是携带重要的低相对分子质量物质，如清蛋白携带维生素、脂肪以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 ④提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 ⑤对培养中的细胞起到某些保护作用 有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。现在往往有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。血清蛋白形成了血清的黏度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，利度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，它们在代谢解毒中起重要作用。 购置的血清应做热灭活处理。将小牛血清置于56℃水浴中灭活30 min，以破坏补体及一些污染微生物（如病毒、支原体等），放置4℃冰箱中，无菌试验阴性。未灭活的血清不稳定，应保存于-20℃冰箱中。 贴壁非依赖型细胞 这类细胞无需贴附于支持物表面，可在培养液中悬浮生长，细胞呈球形。例如，杂交瘤细胞、血液内的淋巴细胞和某些产生干扰素的转化细胞，如Namalwa细胞等。细胞悬浮培养的优点是细胞生存空间大，生长时间长，能繁殖出大量细胞，传代方便（不需消化），易于收获，可获得稳定状态。 指数增生期（Logarithmic growth Phase）：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。 污染途径 污染物，特别是微生物常通过下列途径进入培养体系，造成污染 1空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩，以免因讲话、咳嗽等使外界污染进入操作面，造成污染。 2器材：各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染，另外需要对培养箱进行定期消毒，防止形成污染 3操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。培养两种细胞以上时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液、瓶等有可能导致细胞交叉污染。 4血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。 5组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不