厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响.docVIP

厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响 　　作者：张博 作者单位：锦州市中心医院心内科，辽宁 锦州 121001 　　【摘要】 目的 观察厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响，并初探其机制。方法 应用Langendorff装置采用完全停灌复灌的方法制作离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。将48只SD大鼠随机分为3 组：对照组(K-H缓冲液持续灌流110 min)、缺血再灌注组(K-H缓冲液持续灌注至各项指标稳定后，约20 min，停灌30 min，再灌60 min)、厄贝沙坦组(灌注方法同缺血再灌注组，但将K-H缓冲液内加厄贝沙坦10-6 mol/L)。(1)取每组8只观察心肌组织氧化物歧化酶活性，丙二醛含量变化。(2)每组其余8只：①对照组K-H缓冲液持续灌流170 min。②缺血再灌注组和厄贝沙坦组持续灌注至各项指标稳定后停灌30 min，再灌注120 min。观察对细胞凋亡的影响。结果 (1)缺血再灌注组大鼠心肌组织中丙二醛含量较对照组明显升高(P0.01)，总超氧化物歧化酶活性较对照组明显降低(P0.01)。(2)厄贝沙坦组与缺血再灌注组比较，总超氧化物歧化酶活性明显升高(P0.01)，丙二醛含量明显降低(P0.01)。(3)缺血再灌注组细胞凋亡指数显著高于对照组(P0.01)。(4)厄贝沙坦组细胞凋亡指数与缺血再灌注组比较显著降低(P0.01)。结论 厄贝沙坦有抑制心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的作用。其机制可能与厄贝沙坦清除氧自由基，减少脂质过氧化有关。 　　【关键词】 再灌注损伤 细胞凋亡 　　近来研究表明，细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发病机制的重要环节之一，且发现心肌损伤加重与心肌细胞凋亡增加同时并存。国内外多项试验表明血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可以抑制缺血再灌注损伤发生，调节细胞凋亡[1]，而厄贝沙坦是一种新合成的血管紧张素受体拮抗剂(ARBs)，厄贝沙坦是否具有同样的抗缺血再灌注损伤的保护作用，相关研究较少。本试验应用Langendorff离体工作心脏模型，排除神经体液和外周血管阻力对药物作用的影响，研究厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 选用SD大鼠 48只，体质量250～300 g(辽宁医学院实验动物中心提供);厄贝沙坦：杭州圣诺菲圣德拉堡民生制药有限公司;总超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;Annexin- V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒由北京赛宝生物技术有限公司提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 离体心灌流模型建立 术前1 h大鼠腹腔注射肝素(1 000 U/kg),3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后迅速开胸取心,主动脉插管悬挂于Langendorff灌流装置上,灌流后复搏。灌流液为95%O2+5%CO2饱和的KrebsHanselet(KH)磷酸缓冲液,灌流压70 cm H2O,温度稳定在37 ℃。电极置心脏左上及右下角,连Medlab生物信号处理系统记录心电图。左心室插管经换能器记录血流动力学参数。主动脉插管夹闭30 min停止灌流,然后放开60 min恢复灌流建立IR模型。 　　1.2.2 试验分组 随机分为3组：对照组、缺血再灌注组、厄贝沙坦组，每组16只。(1)每组各取8只：①对照组：大鼠心脏离体后在灌流装置上以KH液持续灌流110 min。②缺血再灌注组：离体心脏在灌流装置上以KH液稳定灌流20 min,主动脉插管夹闭30 min后放开60 min。③厄贝沙坦组：灌注方法同缺血再灌注组，但将K-H缓冲液内加厄贝沙坦10-6mol/L。(2)每组其余8只：①对照组K-H缓冲液持续灌流170 min。②缺血再灌注组和厄贝沙坦组持续灌注至各项指标稳定后停灌30 min，再灌注120 min。 　　1.2.3 总超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量测定 　　再灌结束后立即取下心脏，剪掉心房、右室及心脏表面脂肪组织，滤纸吸干，取左室游离壁同一部位心肌，置-70 ℃冰箱保存，实验结束后制成10%心肌匀浆，按试剂盒说明用黄嘌呤氧化法测定总超氧化物歧化酶活性，用TAB比色法测定丙二醛含量。 　　1.2.4 心肌细胞凋亡率测定 再灌注结束后取左室游离壁同一部位心肌组织，用Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡。将心肌组织制成细胞悬液，细胞浓度为1×109个/L。取1 mL细胞，1 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清。加入1 mL冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。重复上述步骤2次。将细胞重悬浮于200 ΜL Binding Buffer。加入10 ΜL AV和5 ΜL P