实验6凝胶层析分离技术—血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离.docVIP

实验6、凝胶层析分离血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离 一、实验目的 1. 掌握凝胶层析的基本原理。 2. 熟悉凝胶层析的操作过程。 二、实验原理 凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。 三、 试剂配制 1、葡聚糖凝胶：sephadexG-25 2、洗脱液pH7.2，0.1mol/L磷酸盐缓冲液取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml和0.1mol/L磷酸二氢钠280ml混匀。0L。 3、0.2%（m/v）血红蛋白溶液 4、0.0%（m/v）核黄素(VitB2)溶液 5、样品液：0.05%核黄素(VitB2)与0.2%血红蛋白液等量混合置4oC保存。 注意：核黄素需近期生产，并新鲜配制。 四、主要仪器设备 1、恒流泵 2、层析柱：高25～40cm，内径1cm。 3、自动收集器 4、紫外检测仪 5、台式记录仪 五、实验步骤 1、凝胶处理； 溶涨与浮选：称取SephadexG-25 5g加磷酸盐缓冲液50ml，置于水中浸泡6小时沸水浴中为2小时。搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬浮，如此反复多次。 2）平衡：将浸泡后的凝胶，用倍量的洗脱液处理约1小时，搅拌后继续去除上层细浮悬液。 2、装柱： 取直径0.8～1.2cm长25～30cm的层析柱一支,下端出口接上乳胶管并垂直安好。自柱顶部倒入脱液约3-5cm高即行关闭。应避免在柱管和砂芯内出现气泡。将处理好的凝胶在烧杯内用2倍的溶液以细玻璃棒搅成悬液，顺玻璃棒或漏斗自柱顶部沿管壁缓缓加入。待凝胶沉积至2cm时，打开底端出口管，使缓冲液流出，同时继续倒入凝胶悬液，直至凝胶床高度达20cm左右为止, 立即关闭下端出口管。 注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续,不得有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。 3、平衡： 柱装好后，使色谱床稳定5-10分钟，然后接上恒流泵，打开出口用2倍于床体积的洗脱液平衡，使色谱床稳定。流速为0.3ml/min。约1-2h。 注意；在洗脱时，要将恒流泵至色谱柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速。另外务必防止流速过大以及过小，造成色谱床液体流干。 4、色谱床的检查： 5、加样与洗脱： 打开平衡好的色谱柱底部出口，使柱内溶液凹液面与床表面相切时关闭，将吸有0.5ml样品的移液枪在床表面1cm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后，再打开底端出口使样品流至床表面并与床表面相切。用少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面l-2次，然后将洗脱液在柱内约加至2cm高，接上恒流泵并调好流速即开始洗脱{注意：在加样和洗脱过程中防止冲坏床表面)。 6、收集与测定： 收集时可用自动收集器，流速约为1ml/管/3min。约需收集30管左右。洗脱速度不可过快，以免影响紫外检测仪的灵敏度。 紫外检测仪的使用请参照说明书，本实验所用的波长为254nm灵敏度为0.2A使用前需预热两小时。 台式记录仪的使用请参照说明书。紫外检测仪的检测信号输入台式记录仪，台式记录仪绘制洗脱曲线。本实验所用的量程为10mV，走纸速度为12cm/h。 7、实验完成后，用蒸馏水洗脱30分钟，冲洗整套柱体系，然后将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。 注意事项： 1．在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗脱速度控制在0.3mL/min。 2．加样时，保持凝胶上平面不被搅动。 3．液面要始终高于凝胶上平面，否则会导致干柱 4．装柱避免出现断层、气泡。