实验所用的方法.docxVIP

RNA 抽提1) 取50mg肝组织（或2×107细胞）放入装有1ml Trizol的15ml离心管中匀浆；2）转入1.5ml 离心管中，静置5 min；3) 加入200μl 氯仿，颠倒混匀后室温静置5 min；4) 置于4℃离心机中，10000g， 15 min；5) 吸取上清到另一个离心管中，加入等量的异丙醇，颠倒混匀后静置10 min；6) 置于4℃离心机中，10000g，离心10 min后弃上清；7) 加入2ml 75％乙醇，洗涤两次沉淀后弃去乙醇；8) 置于4℃离心机中，10000g，离心10 min后弃去上清，自然风干；激光共聚焦显微镜观察移植的干细胞在小鼠肝脏的定植1) 取液氮中保存的肝组织，进行冰冻切片；2) 加入100μl 4%的多聚甲醛固定液室温放置10min后用PBS洗去；3) 加入100μl DAPI 工作液室温放置10min后用PBS洗去；4) 封片，激光共聚焦显微镜观察。免疫组化检测肝脏α-SMA1) 将石蜡切片经 70℃高温烘烤 20-30min 至石蜡融化，立即经新鲜二甲苯（共两缸，各浸泡 15min）和酒精（无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇和 75%乙醇中依次浸泡 10min）脱蜡脱水；2) 自来水冲洗 15min，水流速度不宜过快；3) 煮沸热修复法修复抗原：水浴锅加热抗原修复液至微沸，放入切片，微煮沸10-15min；4) 抗原修复后，自来水冲洗 10min，PBS 洗 2 次，各 5min（以下步骤中冲洗步骤相同）；5) 先画圈，3%H2O2（用 PBS 稀释）滴加在玻片上，室温静置 20min；6) 冲洗；7) 滴加正常山羊血清封闭液，37℃，40min，甩去封闭液；8) 滴加一抗（兔抗小鼠抗 -SMA 抗体）50μl（阴性对照为一抗稀释液），室温静置 4h 或者 4℃过夜（4℃过夜后需在 37℃复温 45min），冲洗切片，PBS 洗 2次；9) 滴加生物素标记的二抗（羊抗兔）50μl，室温静置，或 37℃ 40min，冲洗切片；10) DAB 显色 5-10min，在显微镜下掌握染色程度；苏木精复染（时间根据苏木素的好坏而不同），自来水冲洗 15min；11) 切片置于 75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和无水乙醇中依次浸泡 2min，再置于新鲜的二甲苯中浸泡 5min，共三缸；12) 中性树胶封片。注：整个实验中都不要干片，抗原修复液的配制：0.001M EDTA 缓冲溶液（pH8.0）：EDTA 0.372g，Tris.base1.2114g（1000ml）（不需调 pH 值）；0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）：枸橼酸钠 2.58g。Western blot 检测肝内α-SMA 蛋白的表达1) 收集肝脏样本，加入 500ul 的细胞裂解液，采用匀浆器裂解肝组织，4℃放置30min；2) 4℃，10000g 离心 5min，收集上清；3) Braford 法定量；4) 常规方法配制分离胶和积层胶；5) 在收集到的蛋白质样品中加入等量上样缓冲液后，煮沸 5min 以变性，行SDS电泳，蛋白上样量为 100ug；6) 半干法进行电转移，恒压 20V，转膜 50min；7) 丽春红染液染色，标记标准蛋白的条带位置，TBS 清洗；8) 10%脱脂奶粉室温下封闭 2h；9) 加兔抗鼠抗 -SMA 抗体，抗体用 1%的脱脂奶粉稀释，4℃孵育过夜；10) TBST 洗膜，重复 4 次，每次 10min；11) 加 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗，通用二抗用 1%的脱脂奶粉稀释，室温下孵育 2h；12) TBST 洗膜，重复 4 次，每次 10min；13) 暗室 ECL 显影，结果扫描并定量分析。注：β-actin 作为内参。上样缓冲液的配制：100mmol/LTris 碱、200mmol/L 的二流苏糖醇、4% SDS、20%甘油和 0.2%溴酚兰；TBST 的配制：10mmol/L Tris 碱、150mmol/L 的氯化钠和 0.05% Tween20，调节 pH至 8.0流式细胞仪检测细胞凋亡试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。2. 3ml　PBS洗涤1次。3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。5. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。6. 用1ml　PI染液染色，4℃避光30min