基因诊断与基因治疗-.ppt

基因诊断和基因治疗 南通大学医学院生化教研室 基因病分为三大类： 基因诊断的特点： 1、病因诊断： 二、基因诊断的对象 1、病原生物的侵入 二、基因诊断的对象 二、基因诊断的对象 基因诊断的基本策略： 基因诊断的基本步骤： 三、基因诊断的常用技术 核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 限制性片段长度多态性（RELP） 扩增片段长度多态性（AFLP） 等位基因特异的寡核苷酸（ASO） 单链构象多态性（SSCP） 基因芯片 1、核酸分子杂交 原理： 利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或RNA定性定量分析。 核酸分子杂交－－核酸印迹杂交 DNA印迹杂交（ Southern blot） RNA印迹杂交 （Nouthern blot） 斑点印迹杂交 （Dot-blot） 原位杂交 (situ hybridization) 核酸印迹杂交基本过程： 核酸印迹杂交基本过程： （2）制备探针： 核酸印迹杂交基本过程： 2、聚合酶链反应（PCR) 耐高温DNA聚合酶－－－Taq酶 3、限制性片段长度多态性（RFLP） RFLP类型： （四）扩增片段长度多态性（AFLP） AFLP原理： 首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板。为达到选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（1～3个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。 5、等位基因特异的寡核苷酸（ASO） 6、单链构象多态性（SSCP） 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的 空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或 多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变， 空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺 凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构 象上有差异的分子分离开. PCR-SSCP基本过程 ①PCR扩增靶DNA ②将特异的PCR扩增产物变性后快速复性; ③将单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; ④通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变. 7、基因芯片 基因芯片技术： 目的：检测外源性基因的侵入 艾滋病与HIV病毒 2、在遗传病检测中的应用 3、在肿瘤检测中的应用 癌基因激活变化及检测： 抑癌基因的检测：Southern PCR 免疫组化筛选提高检出率 第二节 基因治疗（gene therapuy) 基因治疗的策略： 基因治疗基本程序; 用于基因治疗的基因应满足以下条件： 基因载体： 病毒介导的基因转移 逆转录病毒结构: 逆转录病毒生活周期: 构建逆转录病毒载体： （1）构建重组野生性病毒：插入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。 （2）制备辅助细胞（293T细胞），为载体DNA提供其丧失的功能。 （3）载体DNA导入辅助细胞，产生病毒载体。 （4）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。 腺相关病毒(AVV ) 一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需 要其他基因才能复制。 转染细胞后的筛选： 基因治疗的应用及展望 呈待解决的问题： 外源基因表达效率 外源基因表达调控 遗传性疾病面临的免疫问题 反转录病毒载体随机插入的外源基因，若插入不当，可能破坏另一个基因的表达或激活其它基因（潜在的危险）。 结构： rep基因－－编码病毒的复制、整合功能所需蛋白 cap基因－－编码病毒结构组分 ITRs序列－－反向末端重复，定义基因的开始和 结束，制约DNA序列大小，包裹入 衣壳。 细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。 骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞 选择原则: 1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输 回体内。 2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年， 至病人的整个生命。 3、易于受外源遗传物质的转化。 4