第四章酶的分子修饰与模拟.pptVIP

第四章 酶的分子修饰与模拟 为什么要对酶分子进行修饰？ 酶的分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 天然酶在应用中的限制因素： 容易变性失效：一般经不起高温、强酸、强碱、有机溶剂及时间等的考验； 作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解； 酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应实际生产工艺要求。 本章内容提要 4.1 酶的化学修饰 化学修饰是在酶分子一级结构水平上的改造 化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。 化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。 4.1 酶的化学修饰 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 金属离子置换修饰 定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。 应用范围：只适用于分子结构中本来含金属离子的酶 常用金属离子：二价金属离子，如：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。 一般操作方法： 　酶液?加入EDTA?透析或超滤?加入不同的金属离子 金属离子置换修饰 置换后结果 酶活性降低或完全失活 酶活性提高或稳定性增加 锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，活力提高20~30%；制成结晶，活力提高2~ 3倍； ?-淀粉酶由杂离子型置换为钙离子型，结晶后活力提高3倍以上，并且稳定性大大增加。 4.1 酶的化学修饰 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 大分子结合修饰 定义：利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。（使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。） 修饰条件控制：修饰剂的种类与浓度、温度、pH和反应时间等。 大分子结合修饰 大分子结合修饰的过程： 修饰剂的选择：根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 修饰剂的活化：大分子修饰剂在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。 修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与酶液混合，控制一定条件，使修饰剂活化基团与酶分子的侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。 分离：通过凝胶层析等方法将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 大分子结合修饰 大分子结合修饰的作用： 提高酶活力 增加酶的稳定性 降低或消除抗原性 机制：修饰剂通过共价键与酶分子结合后，可使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 实例： 右旋糖酐:核糖核酸酶＝6.5 : 1，活力提高至原酶的2.25倍; 右旋糖酐:胰凝乳蛋白酶＝11:1，活力提高至原酶的5.1倍; 右旋糖酐:胰凝乳蛋白酶＝11: 1，活力提高30%。 机制：酶可与大分子修饰剂形成复合物，起保护酶的天然构象的作用，从而增加其稳定性。 酶活力减少到原来的一半所经过的时间称为酶的半衰期。 酶的半衰期长，说明其稳定性好。反之，稳定性差其半衰期就短。 实例： 机制：抗体与抗原间的特异结合是由于它们间的特定分子结构所引起的，酶经水溶性大分子修饰可使酶的结构产生某些改变，从而降低甚至消除其抗原性。 实例： 精氨酸酶经PEG修饰后，抗原性显著降低 用PEG对色氨酸酶进行修饰，可完全消除其抗原性 PEG修饰后的L-天门冬酰胺酶，也可完全消除其抗原性 大分子结合修饰 大分子结合修饰的作用： 提高酶活力 增加酶的稳定性 降低或消除抗原性 4.1 酶的化学修饰 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶蛋白侧连基团修饰 定义：用小分子化合物对酶蛋白侧链基团进行修饰。可引起副键的改变，使酶分子空间结构发生某些改变，从而引起酶的特性和功能的改变。 被修饰的侧链基团：主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等 经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 亲电的Tyr、Trp 羧基的化学修饰反应 氨基的化学修饰反应 巯基的化学修饰反应 咪唑基的化学修饰反应 酚羟基的化学修饰反应 胍基的化学修饰反应 色氨酸吲哚基的化学修饰反应 酶蛋白侧连基团修饰 酶蛋白侧链基团修饰后效果 提高稳定性 O-甲基异脲修饰