第六章细胞融合初稿.pptVIP

第六章 细胞融合 (Cell fusion) 6.1 概述 细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交（somatic hybrydization）或细胞杂交（cell hybrydization ）： 在离体条件下用人工方法将不同种或同种不同类型 的单细胞通过无形方式融合成一个杂合细胞,生产 特殊生物制品、分化再生新物种或新品种的技术。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。 目前被广泛地应用于单克隆抗体、生物的远缘杂 交、新品种的培育和人类基因图工作（小鼠和人类 细胞融合）。 6.1 概述 受精：雌雄生殖细胞间的自然融合。 体细胞间的融合现象：Muller（1838）发现脊椎 动物肿瘤细胞的多核现象。其后发现骨髓、肺组织 和各种正常组织及炎症和坏死部位的多核现象。 实验体细胞融合：在细胞培养技术之后。首先 （Lambert）发现体外培养的肿瘤细胞自发融合。 后（Okata,1962）发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤 细胞融合，开创了动物细胞融合的崭新领域。其后 不同动物细胞、植物和微生物原生质体融合技术也 相继发展起来。 6.1.1 细胞融合的意义 细胞融合(cell fusion)：将不同来源的原生质体（动 物细胞）相融合，使之分化再生、形成杂合细胞、新 物种或新品种的技术。 意义：可应用于优先选择改良、克服远缘杂交中的 不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传 性状，从而培养出理想的品种。可以避开生殖细胞的 受精过程，从而在亲缘关系更远的物种间实现基因转 移，创造出自然界中所没有的新物种或杂合细胞。还 可创造细胞质杂种。 6.1.2 细胞融合的原理和融合材料 1、 细胞融合的基本原理：不同的原生质体或细胞→融合细 胞→新生物（或杂合细胞）。 两种不同植物的体细胞经纤维素酶、果胶酶消化，除去细胞 壁，得到原生质体（或动物细胞），通过化学或物理方法诱导 其细胞融合形成杂种细胞；以适当的技术进行杂种细胞的分拣 和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直到分化 发育成杂种植株，实现基因在远缘物种间的转移。 2、融合材料 （1）?植物或微生物原生质体的制备 （2）??动物单个细胞的获得 获得步骤： （1）? 组织的获得、（2）? 组织的消化、（3）原生质体或动 物单细胞的分离。 6.1.3 原生质体的制备与培养 6.1.3.1 原生质体的制备 1.原生质体来源：植物的叶片、根尖、花粉等。 2.?制备原生质体：机械法；酶解法 酶解法：（1）?? 取材消毒 （2）?? 酶解制备 （3）?? 原生质体收集 3.? 原生质体的纯化方法 过滤-离心法； 漂浮法； 沉降法和漂浮法结合 6.1.3 原生质体的制备与培养 6.1.3.2 原生质体培养方法： （1）液体培养法：将纯化后的原生质体悬浮于 液体培养基中培养。 （2）?固体平板法：固体培养基上培养。类似植 物单细胞培养法 （3）双层培养法：在琼脂培养基上部加入一薄 层液体原生质体培养液培养原生质体 6.1.4 动物单个细胞的获得 动物单细胞的获得： 1、组织的获得：处死动物取出组织块，放入小烧杯 中，组织块剪碎1mm3大小加入Hanks溶液，低速离 心，留下组织块。 2、组织的消化：胰蛋白酶消化： ①向组织块中加入30~50倍体积的胰蛋白酶液。 ②37℃水浴内消化，每5~10分钟摇一次。 ③Hanks漂洗两次。 ④800r/min离心5min，弃上液，加入营养液。 6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择 细胞融合技术主要有： 生物法——仙台病毒法 化学法——PEG结合高Ga2+、pH诱导法 物理法——电融合诱导法 融合细胞的选择： 融合细胞的类型：同核体；异核体；多核体。 常用的选择方法：遗传互补筛选法；抗性互补筛选 法；生长特性筛选法；物理特性筛选法；其他方法 6.2.1 生物法——仙台病毒法 灭活的仙台病毒（HVJ）可促使细胞凝结、使 细胞发生融合（HVJ与细胞膜的受体结合）： 1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞 膜间相互渗透，胞质互相渗透。 3.两个原生质体的细胞核相互融合，融为一体。 4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色 体的杂种子细胞。 6.2.2 化