斑蝥酸钠逆转K562AO2细胞多药耐药的机制初探.docVIP

实用肿瘤杂志2007年第5期 斑蝥酸钠逆转K562/AO2细胞多药耐药的机制初探 魏素菊 时爱春 河北医科大学第四医院肿瘤内科 河北050011 摘要 目的: 将斑蝥酸钠（SCA）作用于K562/AO2细胞，来逆转白血病细胞的多药耐药，研究其逆转机制。方法: MTT法测定阿霉素(ADM)对K562/AO2细胞的半数抑制浓度（IC50）；逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mdr1基因水平;用流式细胞术（FCM）法检测P-gp蛋白表达的水平。结果: MTT结果显示,无毒剂量的斑蝥酸钠与ADM联合应用比单纯加ADM(同等剂量)对K562/AO2细胞的IC50降低了1.51倍；耐药细胞（K562/AO2）加斑蝥酸钠前后mdr1基因与P-gp蛋白表达均下降。结论:斑蝥酸钠逆转K562/AO2对阿霉素的耐药的机制可能是它抑制mdr1基因和P-gp表达，使细胞内化疗药物积累增加。 关键词 多药耐药逆转;斑蝥酸钠;机制 多药耐药(MDR)是恶性肿瘤化疗失败的最重要原因之一。研究表明，肿瘤细胞mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)的过度表达是导致肿瘤细胞MDR的重要原因。多年来人们一直致力于多药耐药的研究,但并未取得满意效果。本文通过斑蝥酸钠对K562/AO2细胞MDR的作用和机制研究,为中药逆转肿瘤的多药耐药提供试验依据。 1.1 材料 1.1.1 细胞系和细胞培养：K562细胞:人红白血病细胞株(敏感株),由河北医科大学第四医院科研中心提供; K562/AO2细胞:由K562细胞株经ADM诱导而成,由河北医科大学第四医院科研中心提供。K562细胞、K562/AO2细胞分别接种于含有10%胎牛血清RPMI-1640完全培养液（含青霉素100u/ml,链霉素100u/ml)中,37℃ 、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，3-4天换液一次。K562/AO2细胞培养体系中加入终浓度为1.0ug/mL的阿霉素（ADM）以维持耐药性，实验前无药培养2周。 1.1.2 药物和主要试剂:速溶性阿霉素(Adriamycine, ADM):浙江海正药业股份有限公司产品;维拉帕米(Veral1amll,VRP):上海禾丰制药有限公司产品; 斑蝥酸钠注射液（Disodium Cantharidinate，SCA）:贵州柏强制药有限公司产品。mdr-1单克隆抗体： 北京中杉金桥生物技术有限公司产品;四氮甲基唑蓝（MTT）:博海生物制品公司产品; Trizol：Invitrogen公司产品；DEPC：Sigma公司产品；RT Reagents，PCR Reagents，DNA Marker：TaKaRa公司产品；引物序列（北京塞百盛基因技术有限公司合成）：mdr1上游引物： 5-ACA CCC GAC TTA CAG ATG ATG TCT C-3；下游引物： 5-CGA GAT- GGG TAA CTG AAG TGA ACA T-3 扩增产物为623bp；磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物： 5-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3；下游 5-GAA GAT GGT GAT- GGG ATT TC-3 ；扩增产物为486bpMC型紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司产品;全自动酶标分析仪：HT2型，奥地利公司产品； PCR扩增仪：PE9600型，美国PE公司产品；凝胶图象分析系统：法国VL公司BIO-PROFIF产品。 1.2 方法 1.2.1斑蝥酸钠无毒剂量的筛选[1]：取对数生长期细胞K562/AO2，用RPMI-1640调整细胞悬液浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板内,每孔含1×104 个细胞(100ul/孔),培养24小时后，加入不同浓度的SCA100ul，置于二氧化碳孵箱中,37℃,培养48h后,每孔加入MTT20ul,继续培养4h,弃上清,每孔加入200u1DMSO,微量振荡器振荡10分钟,待蓝色结晶完全溶解后,酶标仪上测定570nm波长的吸光度（A570），经过回归分析,可得出斑蝥酸钠的无毒剂量,即对细胞抑制率小于10%时的药物浓度。 1.2.2 MTT法检测SCA对耐药细胞的逆转作用[2、3]：按上述方法调整好细胞浓度，接种于96孔培养板内,每孔含1×104 个细胞(100ul/孔), 另设对照组（不加药物，改用同量的培基）和空白对照组（不加细胞悬液，改用同量培基）。培养24小时后，并将不同浓度的ADM加入K562（ADM浓度0.16--10 ug/ml）和K562/AO2（ADM浓度5--320 ug/ml），50 ul/孔，加入抗癌药物前0.5h,分别加入终浓度为SCA（0.1ug/ml）或VRP（5ug/ml）50 ul。置于二氧化碳孵箱中,37℃,培养48h后,每孔加入MTT20