石蜡切片方法.docVIP

1.2.5 果实组织结构的细胞学观察 常规石蜡切片法制片(李正理 1978)，略修改，具体步骤如下： 材料的选取 将新鲜果实用锋利的水果刀沿果实赤道面横切，在横切面中部取托杯组织，切成1.0 cm×0.5 cm（宽）×0.5 cm（深）大小（图1）。 图1 梨果实横切面及试验取样点示意图 Fig.1 The diagram of the pear fruit transverse section and experimental sampling site （2）固定 （FAA）固定，花后85 d前的材料用70%酒精，花后85 d后的材料用50%酒精。FAA固定剂的配方见附录。 浸洗 将固定后的材料，用70%酒精浸洗，洗去固定液每隔0.5~1 h换浸洗液次，2~3次。 脱水 经不同浓度梯度酒精65%→75%→85%→95%→100%→100%）进行逐级脱水，65%→95%浓度梯度脱水2 h，在100%乙醇中进行脱水时分次进行，第次40 min，第次20 min。 透明 将材料逐级透明，3/4无水酒精和1/4二甲苯混合液→1/2无水酒精和1/2二甲苯混合液→1/4无水酒精和3/4二甲苯混合液→纯二甲苯→纯二甲苯处理时间0.5~1 h。 浸蜡 将材料先放入低熔点的切片石蜡（52℃54℃）中，在30℃下浸蜡24 h；然后将其放入由蜂蜡（熔点为58℃60℃）和低熔点混合石蜡质量比1：9中，60℃保温浸蜡，每3 h换次混合石蜡，浸蜡时间为6 h。 包埋 浸蜡结束后用镊子转移装有液态混合石蜡（与浸蜡中的混合石蜡相同）的小纸盒中，并迅速冷却，以备切片使用。 切片 根据材料在蜡块中的位置和方向，修整蜡块使其成梯形，然后粘到旋转式手摇切片机的蜡台上进行切片。切片厚度10 μm。展片及粘片在洁净的载玻片上均匀涂上少许蛋白甘油（鸡蛋清和甘油按1：1的体积比用搅拌器搅拌均匀制成），将蜡带小心地放在45℃50℃的水面上，待蜡带展平后捞起，放入35℃温箱中烘干。 脱蜡和染色二甲苯脱蜡后采用番红固绿对染法染色。具体步骤如下： 将玻片标本插入有二甲苯的染色缸中，脱蜡10~15 min，再经1/2二甲苯+1/2无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇，最后降到蒸馏水中待染，以上步骤每级2~3min；番红染液（24 h）→65%乙醇→75%乙醇→85%乙醇→固绿染液（0.51 min）→95%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→1/2二甲苯+1/2无水乙醇→纯二甲苯→纯二甲苯封片、干燥和贴标签 用清洁软布擦去切片材料四周多余的二甲苯，滴上中性树胶，盖上玻片，树胶用量要适当，正好充满玻片下面，避免气泡。在载玻片的一端贴上标签，注明材料名称、制片时间等，最后将制成后的玻片置于切片盒中保存待观察。 观察 OLYMPUS BH-50型显微镜观察并拍照，每个处理3张切片，每张切片观察20个视野。