根癌农杆菌介导的遗传转化.doc

根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展 摘要：根癌农杆菌介导的遗传转化系统因具有操作简便，转化效率高，容易得到单拷贝随机插入的转化子，并且转化子稳定等特点而成为近年来丝状真菌遗传转化的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。本文就根癌农杆菌转化丝状真菌原理、过程、种类、影响转化效率的因素及其应用等方面进行了综述。 　　［关键词］ 根癌农杆菌；丝状真菌；遗传转化 丝状真菌（filamentous fungi) 是真菌中一个很大类群，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。其在自然条件下常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害，在工业、农业、医药及基础生物学研究中具有重要作用。丝状真菌中很多种具有重要的经济价值，还有一些是昆虫、植物、动物和人类的重要致病菌，如绿僵菌（Metarhizium anisopliae)、稻瘟菌（Magnaporthe grisea)和烟曲霉（Aspergillus fumigatus)等。而构巢曲霉（Aspergillus nidulans)和粗糙脉孢霉（Neurospora crassa)由于结构简单，通常被作为真核微生物的“模式”种用于基础研究［1］。由于丝状真菌在经济上和科学中的重要性，多年来一直被广泛地研究。 近年来发展了很多转化的方法，但并非所有方法都适用于丝状真菌。 以往丝状真菌的常规转化方法有PEG介导的原生质体转化，限制酶介导的插入突变（Restriction enzyme-mediated insertional， REMI)等，但是这些转化技术或需要制备原生质体、或转化效率低．阻碍了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。根癌农杆菌介导的转化体系（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)克服了这些缺点．为丝状真菌的遗传转化和功能基因研究提供了有力的工具，现已被广泛地运用于丝状真菌的遗传操作目前已经实现了对泡盛曲霉（Aspergilus awamori)、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)和瓜类炭疽（Colletotrichum lagenarium)等60多种真菌的遗传转化［2］。 1、根癌农杆菌介导遗传转化的丝状真菌的原理和种类 根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌．自然情况下它可通过伤口侵入植物导致受伤部位产生瘿瘤，并将其T-DNA序列转入植物细胞并整合到植物染色体上 ［3］］13］同样原因，当农杆菌浓度过高时由于农杆菌过度生长引起严重污染，也会导致转化率下降。 　　4.5 转化时间对转化效率的影响 转化时间是影响转化效率的另一因素．一些研究也证明48h为最佳共培养时间［14］，随着共培养时间的延长，抗性转化子的数目也随之增多。但是对于不同的丝状真菌来说．所采用的共培养时间差异很大［15］。 　　4.6转化温度对转化效率的影响 共转化温度也是影响转化效率的重要因素．研究者对20～37℃这一温度范围农杆菌的转化效率进行了研究．认为22～25℃是最适的转化温度［16］。过高的转化温度会使农杆菌的转化功能丧失，从而导致转化效率降低。 5、根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用 　　5.1利用基因敲除研究基因功能 利用基因敲除方法可为研究基因功能提供最直接最有力的证据［17］。当T-DNA中含有与宿主基因组同源的序列时，T-DNA就会以同源重组的方式整合进基因组，并且双交换同源重组占相当比例［18］。因此，将目标基因的部分序列克隆至T-DNA 两个边界之间，构建目标基因的打靶载体，然后利用农杆菌介导进行转化，就可以实现目标基因的敲除，进而根据表型变化来研究该基因的功能。 　　5.2利用基因插入突变标记、克隆相关基因 插入突变是另一个反向遗传学的研究方法［19］。当T-DNA中不存在与受体染色体同源序列时， T-DNA主要以异源重组形式整合进染色体基因组中。因此，可利用T-DNA 标签法产生插入突变从而分离克隆真菌相关基因［20］。 6、前景及展望 真菌的遗传转化的效率极大的影响着真菌功能基因组学研究的开展和深入。根癌农杆菌介导的丝状真菌的转化，克服了丝状真菌用常规转化方法转化率低、操作繁杂等缺点。也正由于这一转化系统具有操作简便、转化高效稳定、T-DNA在真菌染色体基因组中的随机插入以单位点为主、位点整合精确且可转移大片段DNA等优点，非常适合于构建各种真菌的随机插入突变体库，有利于新基因的标记和快速克隆［21］，使该系统成为丝状真菌基因组研究的有力工具，并显示出了良好的发展潜力，具有广阔的应用前景［22］。相信随着对农杆菌介导真菌遗传转化各个因素的进一步深入研究和探讨， 更多的真菌将会利用该方法成功地实现遗传转化。 参考