蛋白质微阵列技术.pdf

中国试剂网 3.26.30 3.26.30 蛋白质微阵列技术 微阵列技术在单个实验中能同时分析数千个参数。捕获分子微点在固体支持物上 固定成行列并暴露在含相应结合分子的样品中。基于荧光、化学发光、质谱、放 射性或电化学的读出系统能检测每个微点形成的复合物。这些微小化和平行的结 合分析高度灵敏，方法的分析能力又能被微阵列基因表达分析所放大。在这些系 统中，检测固定的DNA 探针的微阵列与互补靶分子的杂交程度。最近在蛋白质 微阵列领域中的发展展示了它在酶-底物、DNA-蛋白质和不同类型蛋白质-蛋白 质间相互作用中的应用。在本文，我们讨论任何微小捕获-分子-配体 分析系统 理论上的优缺点，并讨论蛋白质微阵列的应用将改变诊断方法和基因组和蛋白组 的研究。 微小平行的微点配体结合分析的基本原理十年前就描述过。在“周围分析理论” 中，Roger Ekins 及其同事 [1–4]解释了为什么微点分析比其他配体结合分析会 更灵敏。那时，采用微小化的免役学分析系统已证明微点技术的高灵敏度和巨大 的应用前景。但是，由微阵列引起的巨大兴趣来自DNA 芯片的工作。在一个有 海量平行方式的反应中测定几千个不同的结合反应的可能性完美地符合生物学 中基因组方法的需要。全基因组测序方面的快速进展[5,6]和表达研究的渐增重要 性[表达序列标签测序]与有效的合成为配体结合分析特异的捕获分子的体外技 术正好匹配。寡核苷的合成和PCR 的放大允许有效产生成千的高特异捕获分子。 主要是微技术和微流术的新进展建立了检测系统，并且计算机技术与生物信息学 的进展与微阵列分析系统快速整合。现在，其中一些是在每平方厘米的面积内放 入几千个不同的寡核苷探针的DNA 微阵列，是能在单个实验中能产生大量的成 对基因组数据的建立良好的高通量杂交系统（见图1）。 但是，从基因表达的研究中知道mRNA 水平与蛋白质表达并不一定相关[7–9]。 蛋白质功能常常依赖于前提蛋白的翻译后处理，并且细胞通路的调节通常依赖蛋 白质间的相互作用和/或诸如磷酸化的反向共价修饰而发生。一个细胞的蛋白组 的分析（即所有蛋白的量化、它们翻译后修饰的检测和这些如何依赖于细胞状态 和环境的影响）没有新实验方法是不可能完成的。高通量蛋白分析方法需要一个 快速、直接和定量的检测方法。因此，需要努力扩大除DNA 芯片的微阵列技术 3.26.30 的应用并建立微阵列方法来描述蛋白组（见图1）[10–12]。 微小配体结合分析：理论上的考虑 周围分析理论表明微小配体结合分析能够获得超高灵敏度。一个采用少量捕获分 子和少量样品的系统可能比一个采用 100 倍多的材料系统更灵敏。Ekins 及其同 事发明了一种基于微阵列的灵敏分析技术，并且证明其具有高灵敏性。有了这个 系统，诸如甲状腺刺激素(TSH)或乙肝表面抗原(HbsAG) 的分析可以定量至毫微 微摩尔浓度的范围（相当于每ml 含106 个分子）。微小化是理解微小结合分析的 关键。捕获分子固定在很小面积的固相载体上，微点—尽管捕获分子在系统中的 数量小，但在微点中能获得高浓度的分子（见图2 ）。 在分析中，靶分子即分析物被微点捕获，但是由于微点的小面积捕获分子-靶分 子复合物的数目低。结果是即使靶分子的浓度低而结合反应具有高亲和力，但捕 获过程并不显著改变样品中靶分子的浓度。如果0.1/K 的捕获分子被固定（K 代 表结合反应的亲和常数），这就是事实。这些所谓的周围分析物分析条件允许这 样的分析：从溶液中捕获的靶分子或分析物的数量直接反应它在分析系统中的浓 度。有趣的是：在周围分析物条件下浓度的测量使得系统独立于样品的真实体积， 而给出的结果却兼容了高灵敏度与低样品消耗。高灵敏度的获得有两个原因。第 一，结合反应发生在最可能高的靶浓度。第二，捕获-分子-靶复合物只在微点的 小面积上，从而导致局部的强信号（见图 2 ）。捕获分子以固定浓度固定在不断 增加体积的点上。随着点的体积增加，在分析中的捕获分子的总数增加，从小点 获得的总信号也增加。但是，信号浓度开始随着小点体积增加而减小，因为靶数 量开始成为一个制约因素。捕获过程导致溶液中靶浓度的显著降低，而同时探针 -靶复合物分散在一个较大范围。结果从小点的任何一点获得的最大信号降低。 减小微点的大小将