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酵母菌菌种保藏技术规程 1　范围 本规程规定了酵母菌菌种保藏的技术和程序。 本规程适用于酵母菌菌种的保藏。 2　术语和定义 下列术语和定义适用于本规程 2.1　定期移植法 subculturing 亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适宜的斜面培养基上，最适条件下培养，待得到健壮的菌体后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏方法。 2.2　蒸馏水法 preservation in distilled water 指将欲保藏的菌种细胞悬浮于无菌蒸馏水中，密封后置于4～6℃保存的一种菌种保藏方法。 2.3　液体石蜡法 preservation in liquid paraffin 亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。 2.4　－80℃冰箱冻结法 preservation at －80℃ 指将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种长期菌种保藏方法。 2.5　液氮超低温冻结法 preservation in liquid nitrogen 指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。 2.6　真空冷冻干燥法freeze-drying 指将欲保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。 3　保藏准备工作 3.1　菌种 待保藏的酵母菌菌种必须进行分离纯化，得到纯培养后再进行保藏。 3.2　工具、材料 接种针或接种环、吸管、镊子、75%酒精棉球、酒精灯、试管架、量筒、烧杯、平皿、标签、波美计等。 3.3　器皿 3.3.1　试管 选用平口试管，规格一般为15×150mm。 3.3.2　安瓿管 制安瓿管的材料应为中性玻璃，质地软硬度要适当。管的内径为8mm，长度不小于100mm。 3.3.3　冷冻管 带螺旋口的塑料冷冻管，其螺旋口分为外螺旋和内螺旋两种，规格为1.8mL。 3.4　器皿的清洗 菌种保藏工作所用的器皿要求清洁、透明、无破损、无裂痕。 3.4.1　新玻璃器皿的清洗 新玻璃器皿表面常含有游离的碱性物质，可先用去污粉或洗衣粉洗刷，再用自来水洗净。然后浸泡于1%～2%的盐酸溶液中数小时，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2～3次，干燥后备用。 3.4.2　使用过的玻璃器皿的清洗 用过的玻璃器皿应尽快洗涤。先用自来水洗至无污物，再用去污粉或洗衣粉刷洗干净，用自来水冲干净后再用蒸馏水洗2～3次。洗净的玻璃器皿，不应在器壁上带有水珠，否则表示尚未洗干净，应再按上述方法重新洗涤。 沾染微生物的试管，经灭菌后倒出内容物，将器皿放在热水中，加适量洗衣粉洗涤，用自来水冲洗干净，干燥后备用。 附着有油脂、石蜡等有机物质的器皿，采用去污粉擦除、有机溶剂溶解或洗液浸泡等方法处理后，再按2）项洗涤。 3.4.3　冷冻管的清洗 检查冷冻管是否渗漏。用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30～45分钟，冲洗干净，弃去含有蓝色染料的冷冻管，其余的冷冻管备用。 用蒸馏水将冷冻管漂洗干净即可。 3.5　碘液的配制 称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量蒸馏水使碘溶解，然后定容至500mL，储存于棕色瓶中，配制成原碘液。 吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g用蒸馏水溶解并定容至500mL，储存于棕色瓶中。 3.6　其它 高压灭菌锅、烘箱、恒温培养箱、水分测定仪、普通冰箱、－80℃冰箱、液氮罐、冷冻干燥设备、程控降温仪、超净工作台或无菌室等。 4　保藏方法 以下保藏方法除4.2不适合于分解石蜡的酵母菌菌种外，其它方法均适用于所有酵母菌菌种。 4.1　定期移植法 参见附录A。 4.2　蒸馏水法 参见附录B。 4.3　液体石蜡法 参见附录C。 4.4　－80℃冰箱冻结法 参见附录D。 4.5　液氮超低温冻结法 参见附录E。 4.6　真空冷冻干燥法 参见附录F。 ? 附录1 定期移植法 1　斜面的制备 酵母菌保藏一般用5oBé麦芽汁琼脂培养基或YEPD培养基，其它特殊培养基可另行配制。 1.1　5oBé麦芽汁琼脂培养基 1.1.1　称取一定量的大麦芽粉，加入4倍量温度为60℃的清水，在55℃水浴锅中保温糖化4～6小时，并间歇性搅拌。 1.1.2　用玻璃棒蘸一滴糖化液于白色比色盘内与碘液反应，碘呈色反应为无色时糖化完毕。 1.1.3　用纱布过滤，将滤液煮沸，再用纱布或脱脂棉过滤，得到澄清的麦芽汁。或于糖化液中加入适量蛋清（每500g大麦芽粉的糖化液加入一个鸡蛋的蛋清），煮沸，过滤，也可得到清澈透明的麦芽汁。 1.1.4　用波