PDX模型的建立、分析和应用.pptx

人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、分析和应用 Fei Zhou 肿瘤研究模型 多样化的肿瘤研究模型 病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞 永生化的肿瘤细胞系 2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活） 来源于肿瘤细胞系的移植模型 来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型 Patient Derived Tumor Xenograft 1 新 传统模型：肿瘤细胞系 可以很方便的在体外进行培养和实验 缺点： 在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞逐渐适应体外培养环境而失去原有特性 缺乏肿瘤相关的生长环境 支持性的非肿瘤基质 血液细胞，免疫系统的交互 其他肿瘤微环境因子 2 肿瘤研究模型 使用传统的肿瘤研究模型没能取得临床上的成功！ 肿瘤的多样化和异质性 研究模型与临床病人缺乏相关性 3 4 PDX模型技术流程图 Modified Fig from Oncodesign Biotechnology 为什么使用PDX模型？ 优势 没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选” 能搞保持肿瘤原有特性和异质性 在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定 保留了原有的非肿瘤基质和微环境 可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究 5 PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！ 使用PDX模型 劣势 仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互 可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统 在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐渐取代 使用较低代数的PDX模型进行研究 需要相对便捷的临床肿瘤样本来源 技术水平上有挑战性 移植 + 分析（包括生物信息学平台） 建立和维持的成本较高 相对的建成之后的使用价值也非常高 6 PDX模型的建立 PDX模型的分析 PDX模型的应用 7 PDX模型的建立 关键点 肿瘤宿主 肿瘤接种 肿瘤的冻存和复苏 8 宿主品系 9 小鼠品系 免疫缺陷 Nude T淋巴细胞严重缺失 SCID Severe Combined Immunodeficiency T淋巴细胞和B淋巴细胞缺失 NOD-SCID Non-obese Diabetic SCID 与普通SCID相比NK细胞活性低，更低的免疫恢复几率 NSG NOD-SCID-IL2Rγ-/- 缺失T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞 宿主品系 目前并没有针对不同品系宿主的完整比较 移植瘤生长时间 接种成功率 移植瘤遗传学特性 移植瘤组织学特性 移植瘤传代的稳定性 模型建立情况与肿瘤类型相关 荷瘤小鼠的饲养 设施要求（常规为SPF级IVC饲养） 完善的IACUC政策 10 肿瘤接种 皮下接种 11 Norman E. Sharpless and Ronald A. DePinho, et al. Nature Review Drug Discovery 2006 肿瘤接种 使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种 12 Xiaomei Zhang, et al. Current Protocols in Mouse Biology 2013 肿瘤接种 原位接种 常用途径：肾包膜下接种(Sub-Renal Capsule, SRC) 13 Peter Eirew, et al. Nature Protocols 2010 肿瘤组织的冻存和复苏 冻存液 胎牛血清 + 10% DMSO 保存条件 -80oC：6周 液氮：长期保存 从冻存条件下复苏 37oC水浴快速解冻 14 肿瘤组织的冻存和复苏 通过冻存和复苏可以： 在获得患者知情同意书之前保存样本 保有备份样本进行重复实验 15 PDX模型的建立 PDX模型的分析 PDX模型的应用 16 PDX模型的分析 目的 说明移植瘤与原瘤的相似性 确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定 为PDX模型的应用提供数据支撑 17 需要保存的材料 基因组DNA 使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取 如：排除坏死区域等 冷冻保存 总RNA 避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存 包含mRNA和miRNA 蛋白样本（组织裂解液） 处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂 冷冻保存 18 生物样本库 分析内容 – 常规 临床背景 患者年龄/性别； 肿瘤类别，原位瘤/转移瘤； 治疗史 移植瘤分析 生长曲线； 药理学特性 针对特定药物处理的反应 组织学和分子生物学分析 原瘤 vs. 移植瘤 19 分析内容 – 组织学 病理学染色（HE染色） 确认肿瘤组织结构 20 头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性 Peng et al. Journal of Translational Medicine 2013 分析内容 – 组织学 免疫组织化学染色 （IHC） 常规标记（如细胞增殖、凋亡） 移植的生物标记物（Her2, EGFR, KRAS等蛋白） 研究者感兴趣的蛋白 21 Dong L