实验一收集动物组织的活细胞—RH.pptVIP

显微镜的组成部分 目镜 观察筒 物镜转换台 物镜 标本夹 载物台 X,Y轴旋纽 电源开关 光强调节纽 光源 聚光镜升降旋钮 光阑调节器 调节瞳间距调节屈光度 所需物镜、 聚焦 5、 4、 1、 放入 样品 转换 聚光镜 10X 物镜 2、 3、 40X 物镜 观察 6、 明场观察 ⑴ 观察步骤 思 考 本次实验要解决什么问题？ 采用什么方法来解决这些问题？ 还能用其他什么方法来解决这些问题吗？ 应用这些方法还能解决什么问题？ * Hanks液:平衡盐溶液. 溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。 * * 台盼蓝染色法原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。 中性红染色液(活细胞染色用)(Neutral Red Staining Solution)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成红色的染色液。本染色液配制在pH值较接近中性的，并且和普通的细胞培养液等渗的溶液中，可以用于外周血细胞的活体染色，也可以用于其它活体细胞或组织的染色。????中性红同时也是一种pH指示剂，在酸性时呈红色，在pH6.8-8.0时呈黄色。细胞核中的核酸呈酸性，因此细胞核会被染成红色。由于溶酶体中也是酸性环境，因此溶酶体也是可以被酸性红染色液染成红色的。 * * 实验一 收集动物组织的活细胞并计数和测定成活率 问 题 如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板的数量？ 如何知道水样中某小型生物的数量？ 如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？ 如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？ 实验目的 学习机械分离法获得动物组织的活细胞 学会使用血球计数板测定细胞悬液的细胞密度 掌握活细胞和死细胞的鉴别方法 收集动物组织的活细胞 从组织中分离单细胞的方法有多种： 对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采用机械研磨的方法分离细胞，但这会造成一些细胞的损伤而降低细胞的成活率； 对于比重差异较大的细胞，可以采用离心的方法来分离，例如血液中各种血细胞的分离； 对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔的方法获得。 实验材料 小鼠 小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。 小鼠的处死：颈椎脱位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。 脾脏淋巴细胞悬液的制备 1.机械分离法 用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗中，用D-Hank’s 液冲洗尼龙布，收集细胞悬液于离心管中。 2.低渗溶解红细胞（红细胞溶血） 0.87% NH4Cl 溶液 股骨骨髓细胞悬液的制备 冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hank’s液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。 D-HANK’S液(无钙镁离子的HANK’S液) 配方 NaCl 80.0克 Na2HPO4?2H2O 0.6克 （如为12H2O，则需1.2克） KCl 4.0克 KH2PO4 0.6克 双蒸水 1000毫升 原液稀释10倍即为使用液------ D-Hank’s液 细胞计数和细胞存活率 利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细胞计数和细胞存活率的测定。 细胞计数一般用血球计数板，细胞存活率的测定一般采用染色法。 细胞密度：每ml细胞悬液中的细胞数 细胞成活率：总细胞中活细胞所占的百分比 血球计数板的结构 血球计数板是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网。 每一方格网可分为九个大方格。 四角4个大方格分别被分为16个中方格。 中央大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。中央大方格共含有400个小方格。 双线分隔 血球计数板的原理 白细胞计数法采用四角4个大方格的区域，适用于细胞较大数量较少的样品 红细胞计数法采用中央大方格的区域 血球计数板的原理 计数室大方格边长为1mm，面积为1mm2，中间平台与盖玻片