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实验九：荧光分光光度法测定维生素B 的含量 2 一、实验目的 1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2 的基本原理。 2、了解荧光分光光度计基本原理、结构及性能，掌握基本操作。 二、实验原理 维生素B (又叫核黄素，VB )是橘黄色无臭的针状结晶。 2 2 其分子式为：C H N O ，分子量：376.4。 17 20 4 6 VB2 分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射 荧光。VB2 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中 稳定，光照易分解，对热稳定。 VB 溶液在430 ～440nm 蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰 2 在535nm 附近。VB 在pH ＝6 ～7 的溶液中荧光强度最大，而且其荧 2 光强度与 VB2 溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测 VB2 的含量。VB2 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物 质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比VB2 的荧 光强得多，故测VB2 的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条 件下进行。 实验九：荧光分光光度法测定维生素B 的含量 2 在稀溶液中，当实验条件一定时，荧光强度F 与荧光物质浓度c 呈线性关系：F=Kc ，这是荧光光谱法定量分析的依据。 注意：高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F 与c 不 呈线性关系。 三、主要仪器与试剂 主要仪器：荧光分光光度计；1cm 石英皿；25mL 比色管；1mL、 5mL 移液管 试剂：VB 标准溶液5.0μg/mL；待测样品溶液 2 四、实验步骤 1、系列标准溶液的制备 取 VB2 标准溶液 0.50mL 、1.00mL、1.50mL、2.00mL 、2.50mL 分别置于25mL 比色管中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。得浓 度依次为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.30μg/mL、0.40μg/mL、0.50μg/mL 的一系列VB 标准溶液。待测。 2 2 、激发光谱和荧光发射光谱的绘制 设置λem ＝540nm 为发射波长，在250 ～500nm 范围内扫描，记 录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光 谱图上可找出其最大激发波长λex。 从得到的激发光谱中找出最大激发波长，在此激发波长下，在 450 ～700nm 范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系， 实验九：荧光分光光度法测定维生素B 的含量 2 便得到荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其最大荧光发射波长 λem。数据记录于表1 中。 3、标准溶液及样品的荧光测定 将激发波长固定在最大激发波长，荧光发射波长固定在最大荧光 发射波长处。测量上述系列标准VB 溶液的荧光发射强度。数据记录 2 于表 2 中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐 标，制作标准曲线。 在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知 试样中VB2 的浓度，计算待测样品溶液中的VB2 的含量。 在 Acquire Mode 下有三个模式，分别是 Spectrum 光谱模式， Quantitative 定量模式和Time coure 动态动力学模式。 在Configure 下设置Parameters 参数；在Mainpulate 下Dataprint 记录数据，不建议拷贝图形文件（Presentation/Graph/Copy ）。 五、数据记录与结果