植物细胞培养.pptVIP

1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 三.细胞悬浮培养的方法 1、培养基对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。 2、培养细胞的起始密度及细胞记数 （1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。 最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为104~105细胞/ml 2）细胞记数要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板 讨论: A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体 操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2- 4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。 4、细胞生长的测定  对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。A、细胞记数注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此 通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用5%~8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理生长速率pP=（lnx-lnX0）/tX为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度 B、细胞大小的测定技术（用显微测微计）C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。D、细胞的干重和鲜重。将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。 E、有丝分裂指数在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度越快。一般用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检，统计500个细胞，计算。 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。 6、影响悬浮细胞生长的因素： ?起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 ?接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。 ?培养条件：方式、温度、继代周期 四、悬浮细胞的同步化 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，工作中常用的处理方法：1、物理方法1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 2）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度。2、化学方法1）饥饿法 悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。 2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3）有丝分裂阻抑用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓