大学生物化学之蛋白质.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Pepsin：R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑。 肽链 水解位点 胃蛋白酶 thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R2=Pro或Gly 水解受抑。 R1或R3=Pro 水解受抑。 肽链 水解位点 嗜热菌蛋白酶 谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu (磷酸缓冲液或醋酸缓冲液) 精氨酸蛋白酶： R1=Arg 肽链 水解位点 谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶 木瓜蛋白酶（R1=Arg,Gly\Ala\Leu\Glu\Asp） 和弹性蛋白酶(R1=Ala\Val\Gly\Ser) 化学法：可获得较大的肽段 溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键。 F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。 蛋白质一级结构的测定 测定每条多肽链的氨基酸组成 Edman反应 2、氨肽酶法或羧肽酶法 3、质谱法（MS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快 核糖体 蛋白质链 4.根据核苷酸序列的推定法 G.确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 H.确定原多肽链中二硫键的位置。 采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定 一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离。 + - + - 第二向 第一向 Brown和Hartlay对角线电泳图解 pH6.5 图中黄色斑点是 含有二硫键的肽段 S S HCOOOH SO3H SO3H + - + - 第二向 第一向 a b Brown和Hartlay对角线电泳图解 pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段  同源蛋白质：来自不同生物体、 执行同一 /相似功能的蛋白质 同种蛋白质：来自相同生物体、 执行同一功能的蛋白质 1、同源蛋白质 同源蛋白质的物种差异与生物进化 一百多个AA残基 MW约12.5×103 2 8个不变残基  细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。 细胞色素C与系统树 invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue) nonconservative or variable residues (unshaded) Conservation and variation of cytochrome c sequences 1、氧合血红蛋白 （二）同源蛋白质具有共同的进化起源 该酶类活性中心的Ser残基起关键作用 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 凝血酶和纤溶酶 有序列同源性 对底物偏爱不同 2、丝氨酸蛋白酶类 卵清中的溶菌酶（lysozyme） α- 乳清蛋白（lactalbumin） ——三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。 3、一些功能差异很大的蛋白质 （三）血液凝固与AA序列的局部断裂 凝血酶原 血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。 可溶性的 血纤蛋白原 酶 有活性的凝血酶 不溶性的 血纤蛋白网 （一）肽的人工合成 保护（氨基、羧基、侧链活性基团） 活化（氨基、羧基） 缩合剂 （二）胰岛素的人工合成（三）固相肽合成 肽与蛋白质的人工合成 * 四肽的结构 三、肽的重要理化性质 1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。 2.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端?-NH2和游离末端?-COOH以及侧链上可解离的基团。 3.每一种肽都有其相应的等电点，计算方法与AA