王金福生物化学01课案.ppt

由于蛋白质分子上除了肽链两端有自由的α-NH2和α-COOH外，在侧链上还有很多解离基团（ε-NH2、γ-COOH、β-COOH、咪唑基、胍基（精氨酸）），在一定的pH条件下都能解离成带电基团，而使蛋白质带电。 二、两性电离及等电点 等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。 H 2 O + P C O O - N H 2 H + O H _ P N H 3 + C O O - P N H 3 + C O O H H + O H - pH ＞ pI pH ＜ pI pH =pI 酸性氨基酸pI＜7，碱性氨基酸pI ＞7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性aa较多，其pI偏碱，如从雄性鱼类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多，其pI 约为12 ； 若含酸性aa较多，则pI偏酸。 蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。 蛋白质等电点性质为电泳分离的依据. 三、胶体性质 蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；同时，蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。 四、蛋白质的沉淀作用 如果使蛋白质成为胶体的稳定条件发生变化，就很容易使蛋白质变得不稳定而发生沉淀现象。 这种稳定条件变化方法有： （1）在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏它的水膜或中和它的电荷。如无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，中和电荷作用）、有机溶剂（乙醇、丙酮等，破坏水膜作用）； （2）调节溶液的pH值，使达到蛋白质的等电点而失去电荷； （3）加热法（失去活性）； （4）重金属盐（汞、银、铜盐等）、磷钨酸、三氯醋酸和生物碱等沉淀剂可使蛋白质沉淀（失去活性）。 五、蛋白质变性（denaturation） 在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的非共价键断裂，天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。 蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。 蛋白质变性后其溶解度降低，粘度增加，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。 变性蛋白质不一定都沉降，沉降出的蛋白质也不一定变性。 造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。 复性：有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，能恢复活性。 六、蛋白质的紫外吸收 Trp、Tyr在280nm处有特征吸收峰，可作蛋白质定量测定 七、蛋白质的呈色反应 （1）茚三酮反应（ninhydrin reaction）。 （2）双缩脲反应（biuret reaction）。肽键与双缩脲试剂反应呈紫色。氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度。 第五节 蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质的抽提原理与方法 原 理 大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。 蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。所以，分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因，温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。 提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。 方 法 1、利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 2、将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。 1、盐析及丙酮 沉淀 盐析：大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同。 半饱和硫酸铵 离心 球蛋白沉淀 血清 血清 离心 饱和硫酸铵 白蛋白沉淀 二、蛋白质分离与纯化的主要方法 2、电泳：根据蛋白分子带电性质、电荷量以及分子大小将不同分子物质分开 。 3、透析：根据分子量的大小，用透析袋将大、小分子物质分开。 4、层析：亲和层析、离子交换层析等 5、分子筛：又称凝胶过滤层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖。 6、超速离心 S：单位离心场的沉降速度。1S=1×10-13秒 三、多肽链中aa顺序分析 1、组成分析：蛋白质盐酸水解后成为个别aa，用离子交换树脂将各种aa分开，测其量并算出各aa在蛋白质中的百分组成或个数。 2、N、C端标记 N端：