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第三章 高效液相色谱法(HPLC) 液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。例如，最常用的强极性固定液β，β′一氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个革命性突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。 它由直径为10μm的硅胶微粒凝聚而成。 这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 它包括脱气、梯度淋洗、温控、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 . 工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 二、各部分功能简介 1、高压输液系统 包括溶剂贮存器、高压输液泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 （1）溶剂贮存器：由玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯 塑料等制成容量1～2 L容器，用于贮存足够 数量、符合要求的流动相。 溶剂使用前要过滤和脱气 溶剂脱气方法 抽真空脱气法、吹氢脱气法 超声波脱气法 加热脱气法 B 对高压输液泵的要求： （2）高压输液泵 A 作用：将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续 不断地送入流路系统，它是HPLC的关键 部件，要求压力：150～450×105 Pa。 。 输出压力高:（150～500）×105 Pa； 流量范围宽: 0.1～ 10 mL/min 内连续可调； 流量恒定，无脉冲； 流量精度和重复性好（0.5%以内）； 耐腐蚀、密封性能好。 恒流泵：在一定操作条件下，输出流动相流量保 持恒定，而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵：能保持输出压力恒定，但其流量则随色 谱系统阻力而变化，故保留时间的重现 性差。 它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍 恒流泵分机械注射泵和机械往复泵两种。 C 高压输液泵类别 2、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30 cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 （1）组成：进样口，注射器，进样阀等。 （2）作用：把分析样品快速、有效地送入色谱柱内。 （3）要求：为获得良好分离效果及分析重现性，需 将样品“浓缩地”瞬间注射到色谱柱顶端， 成为一个样点。 准备状态 进样状态 流动相入口 色谱柱入口 样品出口 样品入口 流动相入口 色谱柱入口 样品环 （4）六通阀进样装置工作示意图 3、分离系统——色谱柱 （1）组成：色谱柱（包括固定相）、柱温控制箱、 连接管。 （2）作用：使被分析物质在色谱柱内分离。 （3）色谱柱 标准柱型：内径 4.6或3.9 mm，长度10～30 cm，柱管材料有不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。 填料颗粒度：5～10 μm 。 A 溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤， 防止堵塞。 B 必要时加前置柱。 C 更换流动相要渐变。 D 用后要保护好。 （5）使用色谱柱注意事项： 4、检测系统 （1）作用：将色谱柱流出组分进行检测，并将浓