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比较不同实验条件对酵母酶法破壁得率影响的研究 实验目的：研究不同的酶解条件如温度、时间等对酵母抽提物得率的影响，确定合适的酶解工艺及参数 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种 安琪甜酒曲 1.1.2试剂 木瓜蛋白酶、蜗牛酶、溶菌酶、中性蛋白酶、破壁酶、磷酸二酯酶、菠萝蛋白酶 2.方法 2.1酵母菌培养 （1）将安琪甜酒曲按1：10用36～40℃温水（灭菌后再加热，以防染杂菌）活化20min制成酵母乳液，接种到装有300mlYPD液体培养基（或麦芽汁培养基）的1L锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱中30℃，180r/min培养20h，此时培养液浑浊。 将扩大培养液以20%接种量接种到新的无菌YPD液态培养基（或麦芽汁培养基）中，置于恒温振荡培养箱中30℃，180r/min培养30h，作为破壁菌液备用。 或（2）将顺德酒厂酒糟加入酒曲培养结束后，经加水稀释、过筛除杂、沉降分离、离心分离等步骤得到的酵母泥，再以按10%的接种量接种到装有300mlYPD液体培养基（或麦芽汁培养基）的1L锥形瓶中，置于恒温振荡培养箱中30℃，180r/min培养20h，此时培养液浑浊。 2.2酶法破壁 取100ml酵母菌液，加入250ml锥形瓶中，再加入一定量的酶，考察时间、温度、pH和酶量对破壁效果的影响，筛选适合的酶与添加量，确定合适的酶解工艺及参数。 2.3检测方法 木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、磷酸二酯酶、蜗牛酶、溶菌酶（一般是内外切酶复合使用，所以一般用两种酶，如木瓜蛋白酶与中性蛋白酶或与磷酸二酯酶，蜗牛酶与溶菌酶） 加入牛肉、猪肉制得的肉类酶解液与上述酶一起共用，可生产出具有风味特性的酵母抽提物。新方法可作为申请专利方向。 2.3.1蛋白酶活力测定（紫外法） 蛋白酶活力的定义为：样品在测定条件下水解酪蛋白，每分钟释放出l峭酪氨酸所需的酶量即为一个酶活力单位，以u／mL或u／g表示。测定条件为：样品用量lOOmg，温度37℃，反应时间10min，测定波长275nm。 2.3.2氨基态氮AN％测定(甲醛滴定法) 2.3.3破壁率的检测方法 血球计数法 2.3.4得率（%）= 105℃烘箱干燥法 3.工艺流程 加水 加酶 ↓ ↓ 鲜酵母泥→酵母悬浮液→高压均质→55 ℃自溶→离心分离→酶灭活→真空浓缩 自产新鲜酵母加水调成不同浓度的酵母悬浮液，加入木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，55 ℃水浴摇床中自溶 ，3 500 r/min 离心 5 min，取上清液测定 20 ml 上清液的干物质质量和氨基酸态氮含量。 3.1加酶对破壁效果的影响 分别加0.5%酵母干重的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶于含有100ml酵母菌液的锥形瓶中，自然，55 ℃水浴摇床保温，自溶 8 h，取 20 ml上清液离心， 测定上清液干重及 RNA 含量和氨基酸态氮含量。 空白组不加酶 3.2 pH 值对破壁效果的影响 含有100ml酵母菌液的锥形瓶中，pH 值分别调成 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，分别加入 0.5%的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，55 ℃水浴摇床自溶 8 h， 离心取上清液测上清液干物质量、氨基酸态氮含量 3.3自溶时间对破壁效果的影响 含有100ml酵母菌液的锥形瓶中，pH 值 5.0， 分别加入 0.5%的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，55 ℃水浴摇床自溶，从 2 h开始每隔 2 h 离心取上清液测上清液干物质量、氨基酸态氮含量 3.4温度对破壁效果的影响 含有100ml酵母菌液的锥形瓶中，温度值分别设为 35，38，40，42， 45，分别加入 0.5%的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，水浴摇床自溶 8 h， 离心取上清液测上清液干物质量、氨基酸态氮含量 3.5加酶量对破壁效果的影响 含有100ml酵母菌液的锥形瓶中，pH 值为 5.0，分别加入 0.3%、0.4% 0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的木瓜蛋白酶和中性蛋白酶 ，55 ℃水浴摇床自溶 8 h，离心取上清液测上清液干 物质量、氨基酸态氮含量 3.6复合酶于单一酶对破壁效果对比 含有100ml酵母菌液的锥形瓶中，选用以上实验最佳pH、自溶时间、温度、加酶量作为实验条件，按1：1比例分别加入 0.6%复合酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，pH5.0（采用上述实验最佳pH）,55 ℃（采用上述实验最佳温度）水浴摇床自溶 8 h（采用上述实验最佳时间），离心取上清液测上清液干物质量、 4.结果与讨论