第十章植物细胞培养的基本过程和方法 (2).pptVIP

第十章植物细胞培养的基本过程和方法 第一节 植物细胞的获取 1、外植体的选择：适当生长期的健康植株、细胞之间粘连程度小； 叶片组织 2、外植体的前处理： （1）冲刷材料; 流水 几分钟-数小时 吐温 (2) 表面浸润灭菌；超净台 70%酒精 10-30S （3）深层灭菌； 氯化汞 次氯酸钠 （4）无菌水冲洗。 3min/次 3-10次 二、通过愈伤组织诱导获取植物细胞 愈伤组织的概念--P173 形成过程： 1、起始期； （诱导期） 准备进行分裂 2、分裂期；细胞体积变小→分生状态 3、形成期。大小稳定 内部深层细胞开始分裂 怎样从愈伤组织分离得到细胞？ P175 获得愈伤组织后，挑选质量好的愈伤组织块，用无菌的镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过灭菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。 果胶酶 增强分散效果 细胞生长指标 1、细胞生长计量: 细胞计数 细胞密实体积 细胞鲜重 细胞干重 2、细胞活力测定 ①体积选择法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 第三节 固定化培养 细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。 方法：吸附法、包埋法 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 吸附式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。 第四节 单细胞培养 悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。 1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、条件培养（双层滤纸培养） 第五节 原生质体培养 原生质体的特点: ①具有全能性； ②无细胞壁障碍； ③吸收能力强、分泌能力提高； ④可进行细胞融合。 * * 细胞来源：1、外植体； 2、愈伤组织 一、从外植体直接分离植物细胞 第二节 悬浮培养（cell suspension culture） 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。 1、悬浮细胞的诱导---愈伤组织诱导 要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。 适于悬浮培养 适于再生植株 如何获得符合要求的愈伤组织？ 1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶 是最常用的外植体，特别是幼胚。 2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要 配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。 3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性 好、细胞状态好的细胞不断继代培养。 悬浮细胞生长动态： 基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时，细胞即停止生长。在这种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成S形曲线。 悬浮细胞培养的同步化 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ③抑制法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞 同步化程度。 1、细胞平板培养 平板培养(plate culture)：将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。 单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5×105／ml。 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中